염기서열 특이적 핵산 분석을 위한 신호 리포터로 DNA 형광 라이트업 압타머를 활용하는 분할 혼성화 프로브
2025년 7월 8일
이 프로토콜은 형광 라이트업 압타머 DAP-10-42를 신호 리포터로 사용하는 분할 혼성화 프로브의 설계와 핵산 검출 및 단일 뉴클레오티드 치환이 있는 표적 간의 구별을 위한 응용 프로그램을 간략하게 설명합니다.
우리는 서열 특이적 핵산 분석을 위한 새로운 유형의 형광 혼성화 프로브를 개발하고 있습니다. 가장 최근에는 CRISPR-Cas 시스템을 활용하는 분석으로 하이브리드화 분석 도구가 확장되었습니다. 현재 TaqMan과 같은 최첨단 하이브리드화 프로브 및 분자 비콘 프로브는 핵산 표적을 분석하는 데 가장 많이 사용됩니다.
단일 뉴클레오티드 치환 및 핵산 표적의 정확한 검출은 여전히 실질적으로 어렵습니다. 당사의 프로토콜은 라벨이 없는 형광 신호 판독을 제공하면서 필요한 수준의 세포 활동을 보장합니다. 시작하려면 SLAS를 구성하는 두 개의 변형되지 않은 DNA 올리고뉴클레오티드 가닥의 서열을 설계합니다.
DAP-10-42의 6 내지 39에 대해 뉴클레오티드를 함유하는 단편을 사용한다. 뉴클레오티드 1 내지 8 및 36 내지 42로 구성된 줄기 1을 위치 5에서 부풀어 오른 티민을 제거하고 줄기를 4개의 염기쌍으로 줄이고 말단 시토신-구아닌 염기쌍을 추가하여 줄기 1 프라임으로 변환합니다. 한 SLAS 가닥에 뉴클레오티드 9 내지 29를 포함하고 다른 SLAS 가닥에 뉴클레오티드 30 내지 35를 포함한다.
데옥시 GGTCAT을 첨가하여 뉴클레오티드 9에서 29로 단편의 3개의 프라임 말단 서열을 확장합니다. 그런 다음 데옥시 TGACC로 30 내지 35 단편의 5개 프라임 말단 서열을 확장하여 6-염기쌍 줄기 2를 형성합니다. 이제 데옥시 TT 링커와 핵산 표적에 상보적인 DNA 서열을 사용하여 두 가닥의 줄기 1 프라임을 확장합니다.
이렇게 하면 프로브를 구성하는 가닥 SLAS-U 및 SLAS-S의 시퀀스가 생성됩니다. SLAS-S를 7-10 뉴클레오티드 영역에 보완적으로 만듭니다. 여기에는 단일 뉴클레오티드 치환 부위가 포함됩니다.
그런 다음 SLAS-U의 표적 결합 암이 SLAS-S 영역에 인접한 15 내지 25 뉴클레오티드 단편에 상호적인지 확인합니다. UNAFold 웹 서버를 사용하여 표적 결합 이중체의 용융 온도를 평가합니다. INAMelt 탭을 클릭합니다.
응용 프로그램으로 이동하여 Two State Melting Hybridization을 선택합니다. 왼쪽 및 오른쪽 상자에 5개의 소수에서 3개의 소수 순서로 상호 작용하는 시퀀스를 입력합니다. 그런 다음 분석 온도를 섭씨 22도로 조정하고 1가 및 2가 양이온 농도를 각각 20밀리몰 및 25밀리몰 이온으로 입력합니다.
해당 상자에서 상호 작용하는 서열의 농도를 조정합니다. 제출을 누르고 해당 듀플렉스에 대한 Gibbs 에너지 변화, 엔탈피, 엔트로피 및 용융 온도 값을 검토합니다. 완벽하게 일치하는 표적과 SLAS-S 및 SLAS-U의 표적 결합 암의 용융 온도가 분석 온도인 섭씨 22도 이상인지 확인합니다.
SLAS-S와 일치하지 않는 표적 사이의 듀플렉스가 특이성을 유지하기 위해 분석 온도 이하의 용융 온도를 생성하는지 확인하십시오. 필요한 경우 이러한 조건에 맞게 대상 바인딩 암의 길이를 조정하십시오. 상업용 DNA 공급업체로부터 최종 SLAS-U 및 SLAS-S 올리고뉴클레오티드 가닥을 얻거나 자동 DNA 합성기를 사용하여 사내에서 합성합니다.
Auramine O, SLAS-S, SLAS-U 및 분석 완충액의 원액을 준비합니다. 표적을 제외한 모든 분석 성분을 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스의 마지막 5 x 6 부피에 뉴클레아제가 없는 물을 첨가합니다.
그런 다음 마스터 믹스를 소용돌이치고 회전시킵니다. 각 샘플 튜브에 50마이크로리터를 분배합니다. 다음으로, 한 샘플을 표적 없음 블랭크로, 다른 샘플을 양성 대조군으로 라벨을 붙입니다.
마스터 믹스가 들어 있는 튜브에 10마이크로리터의 표적 함유 샘플을 추가하여 60마이크로리터 샘플을 만듭니다. 블랭크의 경우 10마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 그런 다음 표적 서열을 포함하는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드 10마이크로리터를 양성 대조군 튜브에 피펫팅합니다.
미세 원심분리기를 사용하여 원심분리기에서 모든 샘플을 잠시 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 22도에서 10-60분 동안 배양합니다. 형광 분광 광도계를 사용하여 475나노미터에서 여기 시 540나노미터에서 형광을 측정합니다.
SLAS는 NANOGP8 유전자의 특정 단편을 표적으로 삼도록 맞춤화되었습니다. 표적 M은 SLAS-S 가닥에 완전히 상완적인 반면, 표적 MM은 시토신 뉴클레오티드 위치 1, 423을 가졌기 때문에 SLAS-S와의 불일치가 발생했습니다. 완전히 상호적인 표적 M을 추가하면 형광이 꾸준히 증가하고 45-50분 후에 정체되었습니다.
그러나 10의 신호 대 블랭크 비율로 10분 이내에 명확한 신호를 검출할 수 있었습니다. SLAS는 완전히 일치하는 표적에 대해 높은 형광 신호를 보였지만 일치하지 않는 표적 또는 블랭크에 대해서는 그렇지 않았습니다. 형광 출력은 최대 500나몰의 표적 농도에 따라 선형적으로 증가하여 검출 한계의 정량화 및 결정이 가능했습니다. PCR 증폭 샘플은 다양한 수준의 신호를 보였으며 샘플 2만 형광 임계값 2를 초과했습니다.
검량선을 기반으로 샘플 2의 NANOGP8 앰플리콘 농도는 124+ 또는 13 나노몰로 추정되었습니다. SLAS 신호의 형광 검출은 벤치탑 분광 광도계와 휴대용 형광계 모두에서 일관되었습니다. 20 이상의 신호 대 블랭크 비율도 UV 광선을 사용하여 육안으로 관찰되었습니다.
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개요
본 프로토콜은 신호 리포터로서 DAP-10-42의 사용에 초점을 맞추어, 특정 핵산 분석을 위한 형광 하이브리다이제이션 프로브의 개발 방법을 설명합니다. 또한 단일 뉴클레오타이드 치환을 검출하는 과정에서의 어려움을 해결하는 방법을 다룹니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 형광 하이브리드화 프로브
- 핵산 검출
- 단일 뉴클레오티드 치환
배경
- 현재의 하이브리드화 분석 도구에는 TaqMan 및 분자 비콘 프로브가 포함됩니다.
- 핵산 표적의 정확한 검출은 여전히 어려운 과제입니다.
- CRISPR-Cas 시스템은 하이브리드화 분석 능력을 확장시켰습니다.
- 효과적인 분석을 위해서는 무표지 형광 신호 판독이 필수적입니다.
연구 목적
- 핵산 검출 성능 향상을 위한 분할 하이브리드화 프로브를 설계합니다.
- 단일 염기 치환이 있는 표적들을 서로 구별합니다.
- 정확한 형광 신호를 제공하면서 세포 활성을 유지합니다.
사용된 방법
- 수정되지 않은 두 개의 DNA 올리고뉴클레오타이드 가닥 설계.
- 형광 발현형 앱타머 DAP-10-42의 활용.
- 핵산 분석에서 분할 하이브리다이제이션 프로브의 적용.
- 신호 판독 효율 평가.
주요 결과
- 분할 하이브리다이제이션 프로브의 성공적인 설계.
- 핵산 표적의 효과적인 구별.
- 무표지 형광 신호 판독 입증.
- 단일 뉴클레오타이드 치환 검출 정확도 향상.
결론
- 개발된 프로브는 핵산 검출 능력을 향상시킵니다.
- 이들은 단일 뉴클레오타이드 변이를 분석하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 이러한 접근 방식은 핵산 분석 분야를 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
DNA 형광 발광 앱타머(FLAPs)를 이용한 분할 하이브리드화 프로브 기반의 서열 특이적 핵산 분석은 높은 특이성과 정량적 신뢰도로 단일 뉴클레오티드 치환을 검출해야 하는 지속적인 과제를 해결합니다. 이 접근 방식은 레이블 프리(label-free) 방식의 비용 효율적이고 확장 가능한 형광 기반 판독을 가능하게 하여, 초기 발견 및 스크리닝 워크플로에서 강력한 타겟 검증과 메커니즘적 리스크 제거를 지원합니다. 이 방법의 선택성과 정량적 출력값은 바이오 제약 R&D의 포트폴리오 분류 및 리스크 조정 기반의 단계별 추진 결정에 직접적으로 활용될 수 있습니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 높은 선택성으로 단일 뉴클레오타이드 치환을 검출하여 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 정량적이고 서열 특이적인 형광 출력을 통해 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 완벽하게 일치하는 핵산 타겟과 불일치하는 타겟을 구별함으로써 메커니즘적 리스크 제거를 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 스크리닝 워크플로우를 위해 검증된 무표지 분석 시스템을 준비합니다.
- 분석법 개발을 위해 표준화되고 재현 가능하며 정량적인 형광 측정값을 제공합니다.
- 기존의 또는 휴대용 형광 검출 플랫폼을 사용하여 신속하고 확장 가능하며 휴대 가능한 스크리닝 준비 상태를 구현합니다.
중개 및 전임상 연구
- 임상적으로 유의미한 단일 염기 변이의 검출을 가능하게 하여 중개 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 정량적이고 서열 특이적인 결과물을 통해 발견부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 복잡한 시료 내의 표적 변이를 정밀하게 식별함으로써 생물학적 리스크를 감소시킵니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 분할 하이브리드 프로브 플랫폼은 초기 발견부터 리드 물질 확인 및 전임상 연구까지 통합하며, 가설 검증, 분석법 개발 및 중개 바이오마커 검증을 지원합니다.
- 발견 생물학: 서열 특이적 핵산 검출을 가능하게 하여 가설 검증 및 경로 규명을 촉진합니다.
- 스크리닝: 화합물 또는 표적의 신뢰성 있는 평가를 위해 재현 가능하고 정량적인 형광 출력값을 제공합니다.
- 분석학: 일치하는 표적과 불일치하는 표적 간의 측정 가능한 판독값과 통계적 구별력을 제공합니다.
- 중개 연구: 질병 관련 샘플에서 단일 염기 변이 검출을 가능하게 하여 바이오마커 기반 연구에 부합합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 핵산 표적 및 워크플로우에 적용 가능한 재사용 가능한 무표지 검출 능력을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 단일 뉴클레오타이드 해상도를 가능하게 하여 예측 신뢰도와 타겟 검증 능력을 높입니다.
- 운영적 가치: 라벨 프리의 확장 가능한 검출 방식을 통해 분석 워크플로를 표준화하고 단순화합니다.
- 전략적 가치: 후기 단계의 생물학적 리스크를 줄여 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 리스크 조정 우선순위 지정 및 발견 및 전임상 프로그램의 진전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 핵산 프로브 설계 및 용융 온도 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 정량적 판독을 위해 형광 분광 광도계 또는 휴대용 형광계 접근이 필요합니다.
- 재현성을 위해 프로브 합성 및 분석 조건의 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 상보적 서열과 프로브 암(arm)을 맞춤 설정함으로써 다양한 핵산 표적에 적용할 수 있습니다.
- 특이도는 프로브-표적 이중가닥 안정성과 분석 온도의 세심한 최적화 여부에 달려 있습니다.
