V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

이 프로시저의 전반적인 목표는 환자의 혈장으로부터 HIV RNA를 추출하고, 바이러스 외피 유전자의 V3 영역을 시퀀싱하여 HIV 감염 환자의 바이러스 친화성(tropism)을 추론하는 것입니다. 먼저, nested RT-PCR을 사용하여 HIV gp120의 V3 영역을 증폭합니다. 그 다음, 젤 전기영동을 통해 생성물의 존재를 확인하고, 증폭된 V3 생성물에 대해 집단 기반 시퀀싱(population-based sequencing)을 수행합니다.

마지막으로 베이스 콜링 소프트웨어를 사용하여 서열을 분석하고, genome to pheno 알고리즘을 사용하여 공동 수용체 사용 여부를 추론합니다. 궁극적으로, 이러한 결과는 HIV-1 V3 루프의 집단 기반 서열 분석을 통해 환자의 바이러스 트로피즘이 R5인지 또는 non-R5인지 보여줄 수 있습니다. 따라서 표현형 세포 기반 분석과 같은 기존 방법 대비 이 트로피즘 분석 기술의 주요 장점은, 서열 분석 장비를 갖춘 모든 실험실에서 더 적은 양의 시작 물질로 비용을 절감하며 더 짧은 시간 내에 수행할 수 있다는 점입니다.

이 기술은 500 µL의 혈장으로부터 환자의 바이러스 집단이 CCR5 길항제에 반응할 가능성이 있는지 식별할 수 있으므로 항레트로바이러스 요법 치료와 관련이 있습니다. EasyMag 자동 추출기를 사용하여 HIV RNA를 추출하십시오. 이제 바이러스 집단의 적절한 샘플링을 보장하기 위해 RT-PCR을 설정하기 위한 PCR 클린룸으로 이동하십시오.

이 원스텝 반응에서 각 역전사 반응을 3회 반복 수행하도록 계획하십시오. 바이러스 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하며, 특히 SQV three F1 및 CO 6 0 2 prime repair를 사용하여 HIVV three 영역을 증폭합니다. 반응당 구성 성분을 기준으로 하십시오.

리피터 피펫을 사용하여 증폭할 샘플 수에 충분한 양의 스톡 믹스 용액을 제조합니다. PCR 플레이트의 각 웰에 샘플 믹스 36 µL를 추가합니다. 이제 멀티 채널 피펫으로 전환하여 지정된 각 웰에 RNA 샘플 추출액 수 µL를 분주합니다. 각 분주 단계마다 팁을 교체하도록 주의하십시오.

전송이 완료되면 PCR 스트립 캡으로 웰을 덮습니다. 그런 다음 HIVV three region의 원스텝 R-T-P-C-R이 프로그램된 써모사이클러에 PCR 플레이트를 넣습니다. 네스티드 PCR의 경우, SQV three F two 및 CD four R 프라이머 쌍을 사용하십시오.

PCR 클린룸에서 증폭할 샘플 수에 필요한 시약의 양을 계산하십시오. 네스티드 PCR 믹스를 제조한 후, 리피터 피펫을 사용하여 깨끗한 PCR 플레이트의 웰당 19 µL씩 분주하십시오. R-T-P-C-R이 완료되면 증폭 후 작업실로 이동하십시오.

8채널 멀티채널 피펫을 사용하여 R-T-P-C-R 템플릿 1 µL를 nested PCR 믹스에 분주합니다. 매 분주 시 팁을 교체하십시오. PCR 스트립 캡으로 웰을 닫고 플레이트를 써모사이클러(thermocycler)로 옮겨 증폭을 수행합니다.

온도가 25°C로 돌아오면 써모사이클러에서 플레이트를 꺼냅니다. V3 영역이 성공적으로 증폭되었는지 확인하기 위해, 먼저 젤 전기영동으로 생성물을 분석합니다. CyberSafe 젤 염색약이 포함된 1.6% agarose 젤을 준비합니다.

10 µL 멀티채널 피펫을 사용하여, 8 µL의 PCR 샘플을 각각의 웰에 분주합니다. 또한 각 행당 최소 하나의 웰에 DNA ladder를 로딩합니다.

젤을 약 100V에서 10분 동안 전기영동합니다. 자외선 형광을 통해 밴드를 시각화하고, 사진을 찍어 이미지를 기록합니다. 3회 반복 증폭이 모두 성공한 샘플을 기록하십시오.

필요한 경우, 증폭 산물이 3개 미만인 샘플에 대해 R-T-P-C-R을 반복하십시오. 증폭된 바이러스 cDNA 샘플은 V 3 0 2 F 및 S QV three R one 프라이머를 사용한 DNA 시퀀싱 반응을 통해 추가로 검증합니다. big di 시약을 냉동고에서 꺼내 실온에서 해동하십시오.

분석할 샘플 수에 필요한 시약을 계산하고 준비합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 시퀀싱 반응 믹스 5 µL를 해당 플레이트 웰에 분주합니다. 플레이트를 킴와이프로 덮고 그대로 둡니다.

그동안, 남은 PCR 산물에 멸균수 180 µL를 첨가하여 PCR 산물을 1:15로 희석합니다. 희석된 샘플 1 µL를 해당 플레이트의 바닥에 피펫으로 분주합니다. 샘플 옮기기가 완료되면 항상 팁을 교체하여 다음 웰에 분주하십시오.

스트립 캡으로 플레이트를 밀봉하고 1초간 볼텍싱합니다. 플레이트를 원심분리하려면 속도를 140 5G로 설정하십시오. 회전 속도가 140 5G에 도달하면 회전을 중단합니다.

반응을 진행하기 위해 플레이트를 써모사이클러(thermocycler)에 넣습니다. 각 웰에 3 M sodium acetate 4 µL와 냉각된 95% Ethanol 40 µL를 넣어 DNA를 침전시킨 후, 캡을 다시 닫습니다. 플레이트를 10초 동안 볼텍싱(vortexing)하고, 플레이트를 톡톡 두드려 기포를 제거합니다.

플레이트를 -20 °C에서 30분에서 2시간 동안 보관합니다. 2000 G에서 20분 동안 원심분리하여 DNA를 회수합니다. 스트립 캡을 제거하여 폐기합니다.

플레이트를 폐기물 용기 위로 뒤집어 상층액을 따라냅니다. 뒤집은 플레이트를 종이 타월로 눌러 남은 상층액을 완전히 제거합니다.

플레이트를 감쌀 수 있도록 종이 타월 두 장을 접습니다. 플레이트를 원심분리기에 뒤집어 넣고 140 5G에서 회전시킵니다. 140 5G에 도달하면 회전을 멈춥니다.

그 다음 95% ethanol 155 µL로 세척하고 상층액을 따라냅니다. 이어서 원심분리를 반복합니다. 잔류 ethanol이 모두 증발할 수 있도록 플레이트를 2~5분 동안 그대로 둡니다.

DNA 샘플을 변성시키기 위해, 멀티채널 파이펫을 사용하여 플레이트의 빈 웰을 포함한 모든 웰에 maide용 high dye 10 µL를 분주합니다. 플레이트를 septima로 밀봉한 후, 서모사이클러에 넣고 90 °C에서 2분간 처리합니다. 마지막으로, 샘플 플레이트를 시퀀싱 플레이트에 장착하여 시퀀서에 넣습니다.

데이터 분석의 한 가지 허용 가능한 방법은 소프트웨어인 recall을 사용하여 사람의 개입 없이 자동 베이스 콜링(base calling)을 수행하는 것입니다. Recall은 무료 맞춤형 베이스 콜링 소프트웨어로, 로그인 후 browse 옵션을 사용하여 업로드할 샘플 파일을 선택합니다. 가공되지 않은 시퀀싱 데이터 파일을 찾아 최대 20 megabytes까지 업로드하십시오.

다음으로, 참조 서열을 V three로 설정하십시오. 데이터 처리(process data)를 클릭합니다. 페이지 우측에서 결과 폴더를 선택하여 샘플 목록을 표시합니다.

빨간색으로 표시된 샘플은 실패한 것이며, 초록색으로 표시된 샘플은 통과한 것입니다. 특정 샘플을 클릭하고 보기 버튼을 누르면 시퀀스를 검토할 수 있으며, 페이지 우측의 안내에 따라 시퀀스를 탐색하고 파일을 zip 폴더로 다운로드할 수 있습니다.

바이러스 친화성(Viral tropism)은 geno to pheno 공동 수용체 알고리즘을 이용한 집단 기반 시퀀싱 생성 서열로부터 추론할 수 있습니다. significant 설정의 드롭다운 메뉴에서 motivate 2% 및 5.75% FPR의 임상 데이터 분석을 기반으로 최적화된(optimized) 옵션을 선택하십시오. 이제 분석을 위해 서열을 업로드하거나 붙여넣으십시오.

FASTA 파일 형식을 사용할 수 있습니다. CCR5 길항제에 대한 반응성을 예측하는 geno Tono FPRA 예측 결과를 얻기 위해 다른 내용을 추가하지 마십시오. 생성된 G two P 보고서는 아미노산 형태의 V three 루프 서열을 제공하며, 비 R five 사용 바이러스와 관련된 돌연변이의 관련 위치를 나타냅니다.

보고서 하단에는 위양성률이 제공되며, 이는 CCR five 길항제에 대한 반응 관점에서 해석됩니다. 이 보고서는 PDF 파일로 다운로드할 수 있습니다. 시료에서 얻은 세 가지 서열 중 어느 하나라도 non R five로 추론되면, 환자가 CCR five 길항제에 예상대로 반응할 가능성은 낮습니다. HIV one V three 루프의 RTP CR 증폭 결과에 대한 젤 전기영동 결과, 모든 임상 시료에서 산물이 생성되는 것은 아님이 나타납니다.

증폭된 샘플에서 생성된 서열은 recall로 읽은 크로마토그램에서 시각화할 수 있습니다. 혼합물이 거의 없는 깨끗한 서열이 나타나야 합니다. 때로는 서열이 불분명하여 정확한 염기 지정이 어려울 수 있습니다.

여기에서 보여주는 것과 같이, 일부 환자는 non CCR five 사용 바이러스를 보유한 것으로 확인될 수 있습니다. 이러한 환자들은 CCR five 길항제 치료에 반응할 가능성이 낮습니다. 하지만, G two P 분석 보고서 하단의 녹색 상자로 표시된 바와 같이, 대다수의 환자는 CCR five 사용 바이러스로 구성된 바이러스 군집을 보유하고 있는 것으로 나타납니다.

따라서 이 기술을 숙달하고 나면, 추출부터 분석까지 시작부터 끝까지 약 4일 정도면 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 genome pheno 생물정보학 알고리즘과 함께 집단 기반 시퀀싱 방법을 사용하여 바이러스의 친화성을 예측하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.