제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해

이 프로시저의 전반적인 목표는 subtype-C HIV1 감염자 유래의 gag 유전자를 복제 능력이 있는 HIV1 플라스미드에 삽입하여, gag 서열 다형성이 in vitro HIV1 복제 능력에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 환자의 혈장으로부터 gag 유전자를 증폭합니다. 두 번째 단계는 환자 유래 gag 서열을 복제 능력이 있는 감염성 분자 클론인 MJ-four에 클로닝하는 것입니다. 다음으로, gag-MJ-four 키메라 플라스미드를 트랜스펙션하여 감염성 바이러스 스톡을 생성하고, 지표 세포주에서의 감염성을 평가하기 위해 타이터링을 수행합니다. 마지막 단계는 GXR-25 T-세포주에서 in vitro 복제 능력을 측정하는 것입니다. 최종적으로, 바이러스 복제 역학을 시각화하기 위해 방사성 표지 역전사 효소 분석법을 사용하여 시간에 따른 비리온 생성을 정량화합니다.

오늘 설명해 드릴 방법은 HIV 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 HIV 복제 적응도의 결정 요인을 정의하고, HIV 적응도가 장기적인 병원성에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것이 포함됩니다. 오늘 실험 방법의 설명은 저의 대학원생 두 명인 Jessica Prince와 Dan Claiborne가 맡게 되었습니다.

본 절차를 시작하려면, 원스텝 RT-PCR을 통해 역전사 효소와 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 역전사하고 1차 라운드 DNA 생성물을 증폭합니다. 그런 다음, 1차 라운드 PCR 증폭물 1 µL를 DNA 템플릿으로 사용하여 네스티드 2차 라운드 PCR 증폭을 수행합니다. 다음으로, 2차 라운드 반응액 5 µL에 5X 로딩 다이 3 µL를 첨가합니다.

밴드가 분리될 때까지 UV 형광 DNA 염색제가 포함된 1% agarose TAE gel에서 120 V로 전기영동을 수행합니다. 그 후 청색광 조사기에서 1.6 KB 밴드를 시각화합니다. 그다음, 남은 45 µL의 반응액을 DNA 염색제가 포함된 1% agarose TAE gel에서 전기영동합니다. 깨끗한 면도날을 사용하여 적절한 밴드를 절단하고, 개체당 3개의 양성 반응물을 합칩니다. 이어서 겔 정제 키트를 사용하여 겔 조각에서 DNA를 추출하고 nuclease free water로 용출합니다. 생성물은 추후 사용을 위해 -20 °C에서 냉동 보관합니다. 0:15:56 이 절차에서는 MJ-four 플라스미드의 long terminal repeat 5' UTR 영역을 증폭시킨 후, 조사기에서 1.3 KB PCR 생성물을 시각화합니다. 양성 앰플리콘을 절단한 후, 앞서 설명한 대로 정제하여 냉동 보관합니다. 다음으로, splice overlap extension PCR을 통해 융합된 MJ-four LTR gag 앰플리콘을 생성합니다. 3.2 kb의 긴 앰플리콘을 시각화, 절단, 정제하여 냉동 보관합니다. 이제 1.5 µg의 MJ-four 플라스미드와 1.5 µg의 정제된 LTR-gag PCR 생성물을 BCL-one 제한 효소로 50 °C에서 1.5시간 동안 절단합니다. 이어서 절단 반응액에 1 µL의 NGOM-four를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 제한 효소 절단 반응액에 5x loading dye를 첨가합니다. 전체 부피를 DNA 염색제가 포함된 1% agarose TAE gel에서 100 V로 1~2시간 동안 천천히 전기영동합니다. 앞서 설명한 대로 클로닝을 위해 표시된 밴드를 시각화, 절단 및 정제합니다.

다음으로, 정제된 LTR-gag 삽입물과 MJ-four 벡터 DNA를 3:1의 삽입물 대 벡터 비율로 사용하여 결합 반응을 준비합니다. 결합 반응물을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그런 다음 ligation 산물을 100 µg/mL Ampicillin이 포함된 LB agar 플레이트에 도말하여 JM-109 화학적 컴피턴트 박테리아에 형질전환시킵니다. 형질전환된 박테리아를 30 °C에서 최소 22시간 동안 배양합니다. 클로닝의 정확성을 확인하기 위해, mini prep DNA를 NGOM-four 및 HPA-one 제한 효소로 37 °C에서 2시간 동안 이중 소화(double digest) 처리합니다.

그 후, 1% agarose TAE gel에서 분석합니다. 0.05의 감염 다중도(multiplicity of infection)로 5×10⁵개의 GXR-25 세포를 감염시키기 위해, TZM-BL 세포 분석으로 얻은 µL당 IU 역가를 기준으로 각 스톡에서 필요한 바이러스 부피를 계산합니다. 전신 가운, 안면 마스크 및 이중 장갑을 포함하여 복제 가능 HIV 취급을 위한 적절한 개인 보호 장구를 반드시 착용하십시오. 감염 당일에 바이러스 스톡을 -80°C 냉동고에서 꺼내 해동합니다. 다음으로, 0.05 MOI를 달성할 수 있도록 바이러스를 C-R-P-M-I 배지로 100µL 부피로 희석합니다. 이를 V-bottom 조직 배양 처리된 96-well plate에 첨가하며, 각 복제 실험 세트에는 양성 및 음성 대조군을 모두 포함하고 well 간 교차 오염을 제한하기 위해 한 열 건너 하나씩 빈 열이 되도록 plate를 구성합니다. 그 후, 자동 세포 계수기를 사용하여 GXR-25 세포 수를 세고 모든 감염에 필요한 총 세포 수를 계산합니다. 필요한 부피를 50mL conical tube에 분주하고 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 그런 다음 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 100µL당 5×10⁵ cells 농도의 C-R-P-M-I에 재현탁합니다. 세포를 멸균된 trough에 피펫팅하고 충분히 혼합합니다. 이어서 멀티 채널 피펫을 사용하여, 희석된 바이러스가 들어 있는 96-well plate의 각 well에 100µL의 세포를 첨가하고 충분히 혼합합니다. 그 후, 각 well에 5mg/mL polybrene 용액 2µL를 첨가하고 세포를 충분히 혼합합니다. 그런 다음 5% CO₂ 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 37°C로 3시간 동안 배양합니다.

감염된 세포를 세척하기 위해 96-well V-bottom 플레이트를 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 그 다음, 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 배지 150 µL를 제거하고 신선한 C-R-P-M-I 150 µL로 교체합니다. 세포를 충분히 세척하기 위해 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 마지막 원심분리 후 150 µL의 C-R-P-M-I를 첨가하고 멀티채널 파이펫을 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다. 각 웰의 혼합물을 24-well 조직 배양 플레이트의 웰에 들어있는 800 µL의 C-R-P-M-I에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 2일마다 배양 웰 표면에서 상청액 100 µL를 96-well u-bottom 플레이트의 웰로 옮겨 RT 분석을 위해 냉동 보관합니다. 이후 세포를 완전히 재현탁하고, 세포의 과성장을 방지하기 위해 남은 부피의 절반을 제거합니다. 그 다음, 각 웰에 신선한 C-R-P-M-I 550 µL를 추가하여 원래 부피로 복원합니다.

본 절차에서는 RT 마스터 믹스 1 mL 분주액 각각에 10 mCi/mL DTTP를 1~2 µL, 1 M DTT를 4 µL씩 첨가합니다. 1000 µL 피펫을 사용하여 RT 마스터 믹스, DTT 및 DTTP가 포함된 각 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 조심스럽게 혼합한 후 멸균 트러프(trough)로 옮깁니다.

다음으로, 라벨링된 RT mix 25 µL를 96-well thin walled PCR plate의 각 웰에 분주합니다. RT master mix가 포함된 PCR plate에 각 상층액 5 µL를 첨가합니다. 그런 다음 PCR plate를 접착성 포일 커버로 밀봉하고 써모사이클러(thermocycler)에서 37 °C로 2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 200 µL 멀티채널 파이펫을 사용하여 포일 커버에 작은 구멍을 뚫습니다. 샘플을 5회 혼합합니다. 각 샘플 5 µL를 DE-81 paper로 옮기고 모든 샘플을 10분 동안 공기 중에서 건조시킵니다. 블롯을 각각 별도의 세척 용기에 넣습니다. 이어서 블롯을 1X SSC로 5회 세척합니다. 그런 다음 90% 에탄올로 1회당 5분씩 2회 세척한 후 공기 중에서 건조시킵니다. 건조가 완료되면 블롯을 새란랩(Saran wrap)으로 조심스럽게 감싸고, 밀봉된 카세트에 넣어 실온에서 밤새 phosphoscreen에 노출시킵니다.

준비가 완료되면, 포스포이미저(phosphor-imager)로 포스포스크린(phosphoscreens)을 분석하고 방사성 전사체를 정량화하십시오.

표시됨. 다음은 MJ-four 플라스미드 백본에 클로닝 가능한 환자 유래 gag 앰플리콘을 생성하는 데 필요한 다양한 PCR 앰플리콘의 전기영동 분리 결과를 나타내는 대표적인 겔 이미지입니다. 이 대표 겔 이미지는 환자 gag 유전자를 MJ four에 클로닝하기 위한 제한 효소 절단물의 전기영동 분리 결과를 보여줍니다.

이 대표적인 젤 이미지는 정제된 gag MJ-four 키메라 플라스미드 DNA의 제한 효소 절단물의 전기영동 분리 양상을 보여줍니다. 이 그래프는 GXR-25 세포주에서 시간 경과에 따른 복제 분석의 재현성을 나타냅니다. 약 1년의 간격을 두고 수행된 두 번의 독립적인 실험에서 동일한 gag MJ four 키메라 바이러스를 사용하여 GXR-25 세포를 감염시켰습니다.

복제 점수는 로그 변환된 DLU 값의 기울기를 계산하고, 해당 기울기를 야생형 MJ-four에 대해 정규화하여 생성하였습니다. 두 번의 독립적인 측정값은 강한 상관관계를 보이며, 서로 다른 시점과 서로 다른 계대 세포를 사용하여 수행한 분석의 재현성을 입증합니다. 이 기술은 HIV AIDS 분야의 연구자들이 전 세계적으로 가장 흔한 서브타입인 급성 서브타입 C 감염에서 병원성의 바이러스 결정 요인을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 복제 능력이 있는 HIV를 다루는 것은 매우 위험할 수 있습니다. 살아있는 바이러스가 포함된 모든 단계는 BSL 2+ 시설에서 수행해야 합니다. 모든 표면은 정기적으로 오염 제거해야 하며, 항상 이중 장갑을 착용해야 합니다.