멀티 채널 Microfluidic 장치에서 분리 비즈와 세포 Dielectrophoresis와 층류를 사용하여

이 절차의 전체적인 목표는 인쇄 회로 기판(PCB)을 이용한 유전영동(DEP)을 통해 미세유체 장치 내의 세포와 비드를 조작하는 것입니다. 이는 먼저 PCB 전극과 미세유체 채널을 설계하고 제작함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 PCB 미세유체 어셈블리와 비드 및 세포 용액을 준비하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 채널을 낮은 전도성 배지로 채운 다음, 비즈와 세포를 로딩하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 PCB 어셈블리를 전력 증폭기 및 함수 발생기에 연결한 후 DEP를 시작하는 것입니다. 최종적으로, DEP를 사용하여 미세유체 장치 내에서 세포와 비즈를 분리하고 조작하는 결과를 얻을 수 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 원하는 세포나 비드의 조작을 위한 미세유체 장치용 전극을 효과적으로 개발하기 위해서 사용자가 DEP의 원리를 반드시 이해해야 하기 때문입니다. 반면, PCB를 전극으로 사용하면 다양한 과학 분야에서 미세유체 장치 내의 세포 및 비드 구동을 보다 쉽게 접근할 수 있게 됩니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 불균일 전기장을 생성하기 위해 원하는 기하학적 구조를 갖도록 인쇄 회로 기판, 즉 PCB 전극을 설계하는 것입니다.

설계가 완료되면 상용 제작 시설을 통해 맞춤형 PCB 전극 칩을 주문하십시오. 맞춤 제작된 PCB가 도착하면, 본 시연을 위해 제품을 개봉하여 검수합니다. PCB의 크기는 길이 8.4 centimeters, 너비 2.1 centimeters입니다.

금속 전극의 너비는 5 mm입니다. 본 예시에서 전극은 두 개의 긴 금속 스트립과 전극이 인터디지테이티드(interdigitated) 형태로 배치된 두 개의 4.5 mm 길이 교차 영역으로 구성됩니다. 이러한 인터디지테이티드 영역은 강한 불균일 전기장을 생성하여 자극기와 PCB 전극 사이의 연결을 형성합니다.

16 gauge 와이어를 전극 끝에 배치합니다. 가열된 인두기를 사용하여 PCB의 금속 영역에 와이어를 고정합니다. 이를 통해 와이어가 가열됩니다.

납을 가열된 와이어에 대고 소량의 납이 와이어 속으로 흘러 들어가게 합니다. 와이어에 납이 채워지면, 납이 식는 동안 와이어를 고정한 상태에서 인두기를 제거합니다. PCB의 다른 전기 연결 부위에 대해서도 동일한 납땜 과정을 반복합니다.

다음 단계는 원하는 분지 패턴을 가진 미세 유체 채널을 준비하는 것입니다. 표준 미세 가공 기술을 사용하여 실리콘 웨이퍼와 SU-8 포토레지스트로 채널을 정의하는 마스터 몰드를 제작하십시오. 이 마스터 몰드는 하나의 입력 채널과 세 개의 타겟 채널로 구성됩니다.

채널의 너비는 100 micrometers이며, 채널의 높이는 27 micrometers입니다. 마스터 몰드가 제작되면, polymethyl LAANE 또는 PDMS 엘라스토머를 경화제와 10:1의 중량비로 혼합하여 5분 동안 기다립니다. 액상 PDMS를 미리 제작된 SU eight 마스터 몰드 위에 붓고, 액상 PDMS를 진공 상태에 3분 동안 노출시켜 기포를 제거합니다.

필요한 경우 모든 기포를 완전히 제거하기 위해 진공 과정을 반복하십시오. 필요에 따라 질소 가스 흐름을 사용하여 잔류 기포를 제거할 수 있습니다. PDMS를 70 °C 오븐에서 2시간 동안 경화시키십시오.

면도날을 사용하여 미세유체 채널이 형성된 P-D-M-S-S 랩을 웨이퍼에서 제거합니다. 이때 채널 공간이 위를 향하도록 하여 웨이퍼가 깨지지 않도록 주의하십시오. 생검 펀치를 사용하여 미세유체 장치 내부로 유체와 세포를 주입하기 위한 구멍을 뚫습니다. 가장자리를 다듬습니다.

남은 PDMS를 제거합니다. 미세유체 장치에 먼지나 이물질이 없는지 확인하십시오. 3M Scotch Magic 테이프를 사용하여 PDMS를 세척합니다.

PDMS 채널과 80~130 µm 두께의 깨끗한 0번 커버슬립을 플라즈마 가스에 1.5분 동안 노출시킵니다. 플라즈마 세척기에서 PDMS 칩과 커버슬립을 꺼내 페트리 접시에 옮긴 후, PDMS 미세유체 채널이 커버슬립 위에 놓이도록 플라즈마 본딩을 수행합니다. 커버슬립-미세유체 조립체를 100 °C로 설정된 핫플레이트 위에서 최소 15분 동안 가열합니다. 미세유체 장치 준비의 마지막 단계는 PDMS 채널과 커버슬립을 PCB의 전극 위에 배치하는 것입니다.

먼저 PCB 위에 미네랄 오일 약 10 µL를 도포합니다. PCB와 커버슬립 사이의 밀착을 위해, 커버슬립이 부착된 커버슬립 미세유체 채널 어셈블리를 오일이 도포된 PCB 위에 올립니다. 오일과 접촉한 상태에서 커버슬립 미세유체 어셈블리를 부드럽게 눌러 잘 밀착시키고, 세포 및 비드 시각화를 방해할 수 있는 기포를 최소화합니다.

또 다른 중요한 단계는 저전도성 배지 혼합물(탈이온수에 sucrose 8.5%(w/v) 및 glucose 0.3%(w/v))을 준비하는 것입니다. 이제 미세유체 장치를 사용할 준비가 되었습니다. 피펫을 사용하여 각 미세유체 채널에 저전도성 배지를 15~20 µL씩 채웁니다. 진공 흡입을 사용하여 채널 내의 기포를 제거하십시오.

다음 단계는 테스트 입자를 미세유체 장치에 주입하는 것입니다. 본 시연에서는 마이크로리터당 550개의 폴리스티렌 비드가 포함된 저전도성 배지 현탁액을 사용합니다. 비드는 시간이 지남에 따라 침전될 수 있으므로, 교반하여 비드를 재현탁시키십시오. 그다음 피펫을 사용하여 폴리스티렌 비드 현탁액 200 µL를 채널에 주입합니다.

다음 단계는 전극을 준비하고, 함수 발생기의 출력을 AC 전력 증폭기의 입력에 연결하는 것입니다. 그 다음 증폭기의 출력을 전극 와이어에 연결하십시오. 사용자가 잠재적인 전기 충격에 노출되는 것을 방지하기 위해 모든 전기 와이어와 장치 표면을 전기 테이프로 덮으십시오.

함수 발생기를 1~1.5 megahertz의 사인파 출력을 생성하도록 설정하십시오. 이 설정에서 세포와 비드를 분리하기 위해 DEP를 시작하십시오. 입구 채널은 오른쪽에 있으며, 세 개의 타겟 채널은 삼분 분기점에서 갈라집니다.

PCB 전극은 층류와 DEP가 모두 없는 상태의 검은색 줄무늬에 해당합니다. DEP가 시작되면 비즈는 유동이 없는 상태에서 기본적으로 정지해 있습니다. 층류가 흐를 때 비즈는 PCB 전극 쪽으로 이동하며 전극 사이의 공간에서 멀어집니다.

하지만 DEP가 꺼져 있을 때 유입 채널을 통해 흐르는 비드들은 세 개의 타겟 채널로 나뉘어 흐릅니다. DEP가 시작되고 층류가 형성되면, 비드들은 중앙 채널로만 흐르도록 작동됩니다. 다음 영상들에서는 미세유체 장치를 PCB 전극 위에서 회전시켜 채널의 방향을 변경하였습니다.

PCB 전극을 기준으로 설명하겠습니다. 이전에는 PCB 전극과 수직이었던 유입 채널이 이제는 층류(laminar flow)가 흐르는 상태에서 전극과 거의 평행한 상태가 되었습니다. 하지만 DEP가 꺼진 상태에서는 비드들이 세 개의 타겟 채널 모두에 균일하게 진입합니다.

DEP가 시작되면, 비즈가 삼분점(trifurcation point)에 도달하며 DEP 힘에 의해 전극 위쪽의 측면 채널로 끌려 들어갑니다. 비디오의 다음 그림들은 미세유체 소자 내의 인간 결장 선암 또는 HT 29 세포와 형광 비즈의 혼합물을 보여줍니다. 이 DIC 이미지에서 빈 화살표는 층류의 방향을 나타내며, 채널은 점선으로 표시되어 있습니다.

반사성 금속 전극은 밝은 배경의 스트라이프로 나타납니다. 비드 이미징에는 DIC 현미경이 사용되었습니다. 글로우(glow)의 스케일 강도 이미지는 세포를 더 잘 보이게 하기 위해 사용되었습니다.

이 그림은 다른 그림과 동일한 이미지이지만 글로우 스케일(glow scale) 강도 이미지로 표시되어 세포와 비드를 모두 시각화한 것입니다. 이 그림에서 반사성 금속 전극은 노란색과 녹색 줄무늬로 나타납니다. DEP를 적용하면 비드는 DIC 이미지에서 보는 바와 같이 오른쪽 채널로 배출되는 반면, HT 29 세포는 DEP 시작 전의 글로우 스케일 이미지에서 보이는 것처럼 중앙 및 왼쪽 채널로 배출됩니다. 세포와 비드의 혼합 용액이 하나의 유입 채널에서 세 개의 서로 다른 목표 채널로 흐릅니다.

DEP를 유도한 후, 비드와 세포는 각각 별도의 채널로 선택적으로 구동됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, 미세유체 소자 내에서 세포와 비드를 조작하기 위한 다이얼 전기영동을 어떻게 구현하기 시작해야 하는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.