여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치

다음 방법의 전반적인 목표는 동일한 동적 조건 하에서 서로 다른 효모 균주 유래 단일 세포의 행동을 이미징하는 것입니다. 이는 2층 구조의 미세유체 소자를 제작함으로써 달성되며, 하층에는 서로 다른 각 균주가 개별적으로 포함되고, 상층은 두 번째 단계로서 동적 흐름 조건을 제공하게 됩니다. 서로 다른 효모 균주를 웰에 배치한 후 소자를 밀폐하면, 여러 개의 분리된 균주가 포함된 단일 채널이 형성됩니다.

다음으로, 동적인 배지 변화에 따른 세포 반응을 이미지화합니다. Y 채널의 두 입력단의 유량을 제어함으로써, 서로 다른 균주에 동일한 동적 조건을 적용할 수 있으며 웰 간의 교차 오염이 없음을 확인하였습니다. 이 미세유체 장치는 기존의 다른 시스템에 비해 몇 가지 핵심적인 장점이 있습니다. 동일한 동적 조건 하에서 여러 개의 서로 다른 균주를 이미지화하는 것이 가능합니다.

또한, 중요한 점은 특수 장비 없이 모든 실험실에서 쉽게 제작할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 굶주림 계대 배양(starvation passes)에 대한 서로 다른 야생형 East 분리주의 반응을 추적하는 방법에 대한 논의에서 비롯되었습니다. 우선, 원하는 마이크로채널 레이아웃을 실제 크기로 그리거나 출력하십시오.

다음으로, 유리 슬라이드 위에 스카치테이프를 여러 층으로 붙입니다. 채널의 원하는 높이를 구현하기 위해, 레이아웃 설계를 평평한 표면에 놓고 그 설계 패턴 위에 슬라이드를 맞춥니다. 이제 레이아웃에 따라 유리 슬라이드 위의 테이프를 조심스럽게 절단합니다. 유리 슬라이드의 모든 영역에서 스카치테이프를 제거합니다.

마이크로 채널의 레이아웃에 맞춰 수용합니다. 슬라이드를 65 °C 가열 오븐에 3분 동안 둡니다. 그 후 에탄올로 부드럽게 세척합니다.

제조업체의 권장 사항에 따라 PDMS의 베이스와 경화제 성분을 혼합합니다. 약 30 milliliters의 PDMS 혼합물을 페트리 접시에 붓고 높이를 약 0.5 centimeters로 맞춥니다. 필요한 경우 진공 상태에서 PDMS의 기포를 제거합니다.

패턴이 형성된 스카치 테이프 면이 위로 향하게 하여 유리 슬라이드를 PDMS에 담급니다. PDMS를 부은 후 패턴을 배치하면 슬라이드와 디쉬 바닥 사이에 기포가 생기는 것을 방지할 수 있습니다. 새로운 90 millimeter 페트리 디쉬에 3 milliliters의 PDMS 혼합물을 붓고, 수평계를 사용하여 디쉬가 수평인지 확인한 후 65 degrees Celsius에서 48시간 동안 경화시킵니다.

이 단계는 스핀 코더(spin coder)가 있는 경우 이를 사용하여 수행할 수 있습니다. 앞서 설명한 대로 DGA 및 경화를 진행하십시오. 이제 바이옵시 펀처(biopsy puncher)를 사용하여 미세유체 장치의 유동층을 원하는 크기로 조심스럽게 절단하십시오.

유동층에 입구와 출구를 위한 구멍을 만듭니다. 또한 두 번째 페트리 접시에서 비슷한 크기의 웰 층을 잘라내어 두꺼운 유리에 놓습니다. 그 위에 설계 레이아웃을 미끄러지듯 올립니다.

그 다음, 레이아웃의 마이크로채널과 일치하도록 에탄올을 사용하여 웰(well)을 펀칭으로 뚫어준 뒤, 두 PDMS 층과 유리 커버슬립을 세척하고 공기 중에서 건조합니다. 다음으로, 비가역적 결합을 위해서는 표준 플라스마 식각기를, 가역적 결합을 위해서는 휴대용 코로나 처리기를 사용하여 유리 커버슬립과 웰 층 PDMS를 처리합니다. 접착이 일어나도록 웰 층을 커버슬립 위에 조심스럽게 배치합니다.

기포를 조심스럽게 제거합니다. 적절한 주사기에 원하는 배지를 준비하고, 주사기 펌프에 연결된 타이곤(Tigon) 튜브에 연결합니다. 세포 이미징을 위한 절차입니다.

강도를 활용하십시오. 원하는 상으로 이동하여 배양액을 충분히 Vortex한 후, 300 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. PDMS 웰 층의 각 웰에 canna A 1 µL를 조심스럽게 넣습니다.

con A가 마르는 동안 각 웰에 물을 조심스럽게 피펫팅하여 과량의 con A를 두 번 씻어냅니다. 포도당이 없는 300 µL의 SC 배지로 균주를 두 번 세척합니다. 세포벽에서 잔류 포도당을 세척하는 것은 con A에 적절히 부착되도록 돕습니다.

볼텍싱 후, 세포 현탁액 약 0.5 µL를 개별 웰에 완전히 피펫팅합니다. 풍부 배지를 사용하여 잔류 세포를 부드럽게 씻어냅니다. 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 다음 두 단계는 신속하게 수행해야 합니다.

선택 사항으로, 웰에 직접 닿지 않도록 주의하며 칩과 웰을 플라즈마 처리합니다. 그 다음 실체 현미경 하에서 두 부분의 정렬 상태에 세심하게 주의하며 칩을 웰 위에 조심스럽게 배치합니다. 가볍게 눌러 두 층의 PDMS를 접착시킵니다.

약 50 µL의 풍부한 배지로 장치를 천천히 완전히 채우고, 채널 내부에 기포가 남지 않도록 주의하십시오. 이제 튜브를 적절한 입구에 삽입하여 장치를 연결하고 배지 흐름을 시작하십시오. 튜브 내에 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. 기포가 장치 내부에 갇혀 흐름을 방해할 수 있습니다.

장치를 현미경 아래에 놓고 각 웰에서 적절한 이미징 지점을 찾으십시오. 세포가 회복될 수 있도록 1시간 또는 필요한 경우 그 이상 동안 풍부한 배지가 흐르는 상태로 유지하십시오.

일정한 유량 설정으로 실험을 시작합니다. 펌프 A는 0.8 mL/h, 펌프 B는 0.2 mL/h로 설정하십시오. 배지는 채널 너비의 80% 이상을 흐르도록 합니다.

상대적 유량을 변경함으로써 장치 내의 조건을 동적으로 변경할 수 있습니다. 새로운 조건은 채널 전체에 걸쳐 수 초 내에 안정화됩니다. 서로 다른 균주 간의 분리를 입증하기 위해, 구별 가능한 두 가지 효모 균주를 교차 웰에서 이미지화합니다.

본 실험에서 웰 간의 세포 누출이 없음에 유의하십시오. 동적으로 변화하는 조건의 동시 효과를 테스트하기 위해 두 균주 모두 YFP가 태그된 전사 인자 MSN으로 표지되었습니다. 두 입력 채널의 유량을 변경하여 무포도당 배지의 단계적 변화를 생성하였습니다.

그 결과 MSN two가 핵으로 국소화되었습니다. 중요한 점은, 단일 세포 내의 핵 내 MSN two YFP 수준의 시간적 변화를 분석할 수 있다는 것입니다. 따라서 PDMS 미세유체 장치를 사용하여 여러 웰에 동시다발적인 동적 조건을 적용할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 장치를 조립하는 동안 세포가 건조되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 기술을 숙달하고 나면 소프트 리소그래피 없이도 쉽게 수행할 수 있습니다.