Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae

본 실험 절차의 전반적인 목표는 산화 스트레스를 겪는 효모의 발현 차이를 조사함으로써 학부 과학 전공 학생들이 마이크로어레이 기술을 접하게 하는 것입니다. 이는 먼저 과산화수소로 처리한 효모 배양액과 처리하지 않은 대조군으로부터 총 RNA를 분리함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 이러한 RNA 샘플로부터 cDNA를 생성하고 정제하는 것입니다.

그 다음, cDNA를 사용하여 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 통해 비오틴 표지 cRNA를 준비합니다. 절차의 마지막 단계는 AFI metrics 효모 유전자 칩에 하이브리드화하기 위해 비오틴 표지 cRNA를 단편화하는 것입니다. 최종적으로 두 효모 샘플 간의 발현 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 생물정보학을 통해 학부생들에게 마이크로어레이 분석의 위력을 입증할 수 있습니다.

Vermont Genetics Network Outreach 팀은 버몬트 주 전역의 과학 전공 학생들에게 과학 교육을 강화하기 위해 마이크로어레이(microray) 기술을 전달하라는 임무를 맡았을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 현재까지 이 방법은 주 전역의 8개 학부 대학 내 여러 장소에서 시행되었습니다. 따라서 교육 모듈에 마이크로어레이를 사용하는 주요 장점은 연구실에서 매일 사용되는 일반적인 분자 생물학 기술을 여러 명의 학생들에게 가르칠 수 있다는 점입니다.

또한 우리는 이를 학생과 교사는 물론 저희 연구 그룹 모두를 교육하는 데 활용하고 있습니다. 실제로 학생과 교수가 동일한 프로젝트에서 함께 연구하고 있습니다. 그들은 RNA 취급과 같이 세심한 기술이 요구되는, 결코 쉽지 않은 특정 기법들을 습득하게 됩니다.

학습자들은 시각화 시약을 사용하여 DNA를 침전시키는 방법을 배웁니다. 이를 통해 대학원 과정이나 일반적인 분자생물학 실험실에서 접하게 될 기술들을 실제로 사용해 보게 됩니다. 이 방법은 산화적 스트레스와 효모에 대한 통찰을 얻는 데 적합하지만, 연구하고자 하는 다른 모델 생물이나 다른 생물학적 시스템에도 충분히 적용 가능합니다.

유전자 발현은 발달 과정의 변화, 환경 독소, 특정 질환 상태 등 매우 다양한 요인과 관련하여 변화합니다. 산화 스트레스를 받는 효모의 발현 차이를 조사하기 위해, 먼저 효소 용해법을 통해 두 가지 효모 배양액에서 총 RNA를 추출합니다. 한쪽 배양액은 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) 내의 0.5 millimolar 과산화수소로 1시간 동안 처리하여 산화 스트레스에 노출시켰으며, 다른 배양액은 대조군으로서 HBSS만을 처리하였습니다.

먼저 두 개의 1.7 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 적절한 식별 정보를 기입합니다. 각 튜브에 적절한 효모 배양액 1.5 milliliters를 옮깁니다. 실온에서 5,000 Gs로 2분 동안 튜브를 원심분리합니다.

원심분리 후, 마이크로 파이펫을 사용하여 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 다음 단계로 진행하기 전 펠릿의 크기가 충분한지 확인하십시오. 펠릿이 너무 작다면, 펠릿이 들어 있는 동일한 튜브에 배양액 1.5 milliliters를 추가로 넣고 다시 원심분리하여 더 큰 펠릿을 얻으십시오.

마이크로 파이펫을 사용하여 상층액을 제거하고, 효모 펠렛에서 가능한 한 많은 액체를 없앱니다. 그런 다음 효모 펠렛에 SG buffer 100 µL와 liase solution 30 µL를 넣고 볼텍스로 혼합합니다. 두 튜브를 실온에서 30분 동안 배양합니다.

매 10분마다 각 튜브를 부드럽게 회전시켜 구형 세포(spheroplast)를 생성합니다. 효모의 구형 세포 도말을 수행할 때 가장 중요한 단계 중 하나는 처리 후 실제로 100% 구형 세포가 생성되었는지 확인하는 것입니다. 이는 모든 용해 효소가 동일한 성능을 갖는 것은 아님을 의미합니다.

따라서 적절한 용해 효소를 사용하여 구형 도말(sphero plating)이 잘 이루어지는지 확인해야 합니다. 즉, 이 샘플들을 현미경 슬라이드에 올리고 0.1% SDS를 첨가하여 현미경으로 관찰함으로써 원형질체(protoplast)가 형성되었는지 확인해야 합니다. 완전한 구형 도말을 관찰하려면, 효모 샘플 10 µL를 현미경 슬라이드에 피펫팅하고, 현미경으로 샘플을 관찰하는 동안 0.1% SDS 1 µL를 첨가하여 효모 세포가 팽창하여 완벽한 구형 또는 구상체(spheroids)를 형성하도록 합니다. 이때 출아 세포(budding cells) 또한 구상체를 형성하는지 관찰하는 것이 중요합니다.

부분적인 구형 도말(sphero plating)이 관찰되면, 리아제(liase)를 이용한 처리 시간을 연장하는 것이 권장됩니다. 각 튜브에 350 µL의 BRLT 완충액을 넣었을 때 완전한 구형 도말이 확인되면, 100% ethanol 250 µL를 첨가하십시오. 뚜껑을 닫은 상태로 튜브가 단단히 밀폐되었는지 확인하고 1분 동안 강하게 볼텍싱(vortex)하십시오.

이 절차를 통해 Sphero 플레이트를 용해합니다. 그 후, R 및 easy Z 스핀 컬럼을 사용하여 두 배양액에서 RNA를 수집하고 정제합니다. 마지막으로, 비오틴 표지 CRNA를 준비하기 위해 1.2% precast aros 겔 전기영동을 이용하여 추출된 RNA의 품질을 평가합니다.

효모 세포에서 추출한 총 RNA를 먼저 역전사하여 cDNA를 합성합니다. cDNA 생성 후, cDNA 침전 단계에서 사용할 phase lock gel 튜브를 준비합니다. 겔이 튜브 바닥에 위치하도록 phase lock gel 튜브를 최대 속도로 1분간 원심분리하십시오. phase lock 튜브를 볼텍싱하지 마십시오. cDNA를 침전시키기 위해 pH 8.0 tris 완충 phenyl chloroform, isoamyl alcohol 또는 PCI 혼합물의 하층 162 µL를 피펫으로 취해 2차 가닥 cDNA 합성 반응 튜브의 내용물 162 µL에 첨가합니다. 이 단계에서는 수용액 층과 유기물 혼합액이 동일한 부피로 필요합니다.

내용물을 섞기 위해 5초 동안 볼텍싱합니다. 다음으로, 마이크로 피펫을 사용하여 모든 CD N-A-P-C-I 혼합물을 페이즈 락 겔 튜브로 옮깁니다. 페이즈 락 겔 튜브를 볼텍싱하지 말고 최대 속도로 2분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 phase lock gel 튜브의 상층액을 새로 라벨링한 1.7 milliliter 튜브로 옮깁니다. 상층액을 가능한 한 많이 수집하십시오. 1.7 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 100% ethanol 405 microliters, ammonium acetate 80 microliters, 그리고 pellet paint 1 microliter를 추가한 후 vortex 합니다.

튜브의 힌지 부분이 바깥쪽을 향하게 하여 원심분리기에 넣고 최대 속도로 20분간 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 실온에서 CD NA 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 튜브를 원심분리기에서 조심스럽게 꺼냅니다. 펠릿 페인트로 인해 펠릿은 분홍색을 띠며 크기는 소금 알갱이 정도여야 합니다.

튜브 힌지 아래쪽 측면에 CD NA 펠렛을 얼음 위에 두고 즉시 펠렛 세척 과정을 진행하십시오. CD NA 펠렛 세척 절차를 시작하려면, P 1000 마이크로 파이펫을 사용하여 튜브에서 모든 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 이때 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.

차가운 80% ethanol 500 µL를 샘플 튜브에 넣습니다. 튜브 캡을 살짝 닫고 천천히 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. 펠릿이 튜브 벽면에서 떨어지지 않도록 주의 깊게 관찰하십시오.

펠렛이 떨어져 나온 경우, 튜브를 다시 랙에 꽂아 펠렛이 바닥에 가라앉도록 두거나, 최대 속도로 15초 동안 원심 분리하여 펠렛을 튜브 바닥으로 되돌릴 수 있습니다. 다음으로, P 1000 마이크로 피펫을 사용하여 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 에탄올을 제거합니다. 이때 튜브를 기울여 최대한 많은 양의 액체를 제거하십시오.

차가운 80% ethanol을 새롭게 추가하고, 튜브의 캡을 닫은 후 천천히 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. P 1000 마이크로 피펫을 사용하여 제거 가능한 모든 ethanol을 제거합니다. 튜브를 최대 속도로 5초 동안 원심 분리합니다.

그런 다음 P 10 마이크로 피펫을 사용하여 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 남은 소량의 에탄올을 제거합니다. 튜브의 캡을 열어 건조 박스에 10 내지 20분 동안 두어 남은 에탄올을 증발시킵니다. 펠렛은 건조 후 소실되기 쉬우므로 튜브를 조심스럽게 다루고 캡을 닫도록 주의하십시오.

건조가 완료되면, 튜브 안에 건조된 펠렛이 있는지 시각적으로 확인하십시오. 마지막으로, 건조된 펠렛을 22 µL의 RNA free water에 재부유시킨 후 튜브를 얼음에 놓으십시오. 이 cDNA는 Enzo BioArray 키트를 이용한 인비트로 전사(in vitro transcription)를 통해 비오틴 표지 cRNA를 준비하는 데 사용됩니다.

비오틴이 표지된 cRNA를 정제하고 정량한 후, 타겟 준비를 위해 이를 단편화합니다. cDNA가 생성되면, 표준 인비트로 전사(in vitro transcription) 방법론을 사용하여 비오틴화된 cRNA를 생성합니다. cRNA는 마이크로어레이 칩에 적용하기 전에 단편화 과정을 거쳐야 합니다.

이 절차를 시작하려면, 5 µg에 해당하는 양의 CRNA를 라벨이 부착된 0.5 mL PCR 튜브로 옮깁니다. 전체 부피가 16 µL가 되도록 RNAs free water를 충분히 첨가한 다음, 5x fragmentation buffer 4 µL를 튜브에 넣습니다. 튜브 내의 최종 부피는 20 µL가 되어야 합니다.

튜브를 볼텍싱한 후 10초 동안 원심분리합니다. 그다음 튜브를 94 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 써모사이클러에서 튜브를 꺼내 얼음 위에 놓습니다.

각 샘플에서 얻은 분절 및 비분절 CRNA를 1.2% precast AROS 겔을 이용한 전기영동으로 분석합니다. 전기영동이 완료되면, 트랜스일루미네이터(transluminator)로 겔을 시각화하여 이미지를 획득합니다. 최종 합성 생성물을 atric 효모 유전자 칩에 하이브리드화하며, 마이크로어레이 분석의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다.

첫 번째 그림은 atrics 유전자 칩 작동 소프트웨어로 생성된 스캔된 atrics 효모 유전자 칩 이미지의 예시입니다. 이는 대조군과 처리군의 효모 데이터를 비교한 약 6,700개의 유전자를 포함하는 모든 유전적 전사체의 2D 산점도입니다. 각 점은 단일 유전자를 나타냅니다.

보라색으로 표시된 유전자는 차별적으로 발현된 유전자를 나타내며, 빨간색으로 표시된 유전자는 그렇지 않은 유전자를 나타냅니다. 본 예시에서는 설명란에 명시된 바와 같이 차별적으로 발현된 유전자의 대부분이 세포 주기 조절에 관여하는 유전자들입니다. 주석 시각화 및 통합 발견을 위한 데이터베이스에서 가져온 이 플로우 차트는 영향을 받은 생물학적 경로 내의 차별적으로 발현된 유전자들을 보여줍니다.

빨간색 별표로 표시된 유전자는 유사분열 경로에서 발현이 감소된 유전자를 나타냅니다. 마지막으로, geo species gene sifter 소프트웨어를 사용하여 생성한 볼케이노 플롯(volcano plot)의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 대조군과 처리군 샘플은 P-value 컷오프 0.05 및 1.5배의 발현 변화 컷오프를 기준으로 비교되었습니다.

효모는 빠르게 배양하기 쉽기 때문에 효모를 사용하기로 결정했지만, 효모 작업에서 가장 중요한 부분은 실제로 적절한 구형체 도말(sphero plating)을 만드는 것임을 깨달았습니다. 마이크로어레이에서 피해야 할 점 중 하나는 불완전한 소화를 통해 G1기 또는 G2/M기에 있는 구형체 세포(sphero plast cells)만 얻게 되는 것입니다. 그렇게 되면 특정 복제 단계에 있는 효모만을 대상으로 마이크로어레이 실험을 수행하게 됩니다.

본 실습을 통해 전달하고자 하는 또 다른 복잡한 점은, 사람들이 일상적으로 이야기하는 cDNA 펠렛팅(pelleting)이 생각만큼 쉽지 않다는 것입니다. 따라서 저희 모듈에서는 특수 튜브와 시각화 시약을 실제로 사용하였습니다. 이를 통해 DNA를 원심 분리하여 침전물을 시각적으로 확인할 수 있으며, 이는 학생과 교사 모두에게 학습 과정을 더욱 수월하게 만들어 줍니다.

따라서 개발 후에는 DNA 및 RNA 작업의 모든 단계에서 사용할 수 있습니다. 이 모듈은 학부 교육 기관의 교수진이 기존 교육 과정과 호환되거나 본인의 연구 관심사에 맞는 다른 모델 생물 또는 다른 처리 요법을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다. 수정 사항의 몇 가지 예를 들자면, 한 곳에서는 효모에 대한 제초제 처리의 효과를 살펴보았고, 다른 곳에서는 효모의 LAMP IDE 처리를 연구했으며, 또 다른 곳에서는 특히 관심이 있었던 포유류 세포주의 발달 변화를 연구했습니다.

마지막으로, 또 다른 사이트에서는 서로 다른 광원이 애기장대(arabidopsis) 또는 식물에 미치는 영향을 살펴보았습니다. 이 영상을 시청하고 나면 효모로부터의 총 RNA 분리, cDNA 생성, 그리고 비오틴 표지 cRNA의 단편화를 포함하여, 학부 과학생들과 함께 마이크로어레이 실험을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 수준 높은 기술을 직접 경험하는 것은 학부 과학 교육을 보강하고 강화하는 데 도움이 됩니다.