인간 신경 줄기 세포를 계산
2007년 8월 22일
가능한 세포의 정확한 수를 지식은 많은 조직 문화 조작이 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 hemacytometer를 사용하여 세포를 계량하는 방법에 대해 설명합니다. 그것이 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명하지만, 그것은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.
이제 인간 신경 전구세포의 수를 세는 방법을 보여드리겠습니다. 세포의 수를 세는 과정은 면역 화학 분석을 위해 세포를 배치하거나, 핵인자 기계로 형질전환을 수행하고자 할 때 필요합니다. 저는 가장자리 그리드가 있는 위상차 혈구계수기를 사용하며, 트립판 블루라는 염색약을 사용합니다. 이 염색약은 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분하는 데 유용합니다.
죽었거나 죽어가는 세포는 이 염색약을 흡수하여 파란색으로 나타납니다. 혈구계수기(hemocytometer)로 세포를 관찰할 때, 살아있는 세포는 이 염색약을 배제하므로 파란색으로 보이지 않습니다. 이러한 방식으로 세포의 생존율을 결정할 수 있으며, 이를 위해 트립판 블루(trypan blue)와 배지를 혼합하여 용액을 준비하십시오.
이 0.5 mL 에피 튜브에 트랩 블루 용액 20 µL를 넣겠습니다. 그런 다음 배지 25 µL를 추가하겠습니다. 이렇게 하면 현재 트랩 블루와 배지 혼합액이 45 µL가 되며, 여기에 세포 현탁액 5 µL를 추가하면 1:10 희석 배수가 됩니다.
이제 5 µL의 세포 현탁액을 추가하겠습니다. 먼저 핑거 보텍싱을 통해 세포가 잘 재현탁되었는지 확인하겠습니다. 이제 이 용액이 잘 혼합되었는지 확인하고자 합니다.
이제 베드를 몇 번 위아래로 움직여 섞어주겠습니다. 마지막으로 이 세포 현탁액 약 12 µL를 혈구계수기에 로딩합니다. 혈구계수기에는 두 개의 포트가 있으며, 어느 쪽을 사용해도 무방합니다.
따라서 이 포트에 용액을 주입하기만 하면 모세관 현상에 의해 액체가 빨려 올라가게 됩니다. 이제 카운팅을 시작할 준비가 되었습니다. 10배율로 관찰한 혈구계수기의 모습이며, 여기 16개의 작은 사각형으로 구성된 구획이 보입니다.
보시는 바와 같이, 여기서 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰할 수 있습니다. 여기 이 세포와 이 세포, 그리고 이 세포와 같이 살아있는 세포들이 있으며, 이 세포와 같이 죽은 세포들도 있습니다.
보시는 바와 같이, 죽은 세포는 진한 파란색으로 나타나는 반면, 살아있는 세포는 주변에 일종의 후광이 형성되어 있습니다. 이제 모든 살아있는 세포의 수를 세어 보겠습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 그리고 위에서 아래로 이동하며 진행하겠습니다.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. 따라서 이 사분면에는 총 36개의 세포가 있습니다. 일관성을 유지하기 위해, 여기 이 선을 따라 있는 것처럼 사분면의 경계선에 걸쳐 있는 세포를 셀 때는 왼쪽 경계와 위쪽 경계에 있는 세포들을 카운트합니다.
그리고 저는 혈구계수기의 모든 사분면 경계선에 있는 세포들을 일관되게 계산합니다. 이제 마이크로리터당 세포 수를 계산해 보겠습니다. 이를 위해 사분면당 세포 수의 평균인 38에, 챔버의 규격에 의해 결정된 계수인 10을 곱하겠습니다.
그리고 이번 사례의 희석 배수인 10을 곱합니다. 최종적으로 마이크로리터당 세포 수를 구하게 되는데, 이 경우 마이크로리터당 3,800 cells가 됩니다.
세포 펠렛을 500 µL의 용액에 재현탁했으므로, 총 세포 수를 계산할 수 있습니다. 이제 모든 준비가 완료되었습니다.
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개요
본 프로토콜은 헤모사이토미터를 사용하여 인간 신경줄기/전구세포(hNSPCs)를 계수하는 방법을 설명합니다. 특히 다양한 조직 배양 응용 분야에서 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분하는 것의 중요성을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 조직 배양
배경
- 생존 세포 수는 조직 배양 조작에 있어 매우 중요합니다.
- 살아있는 세포는 특정 염색약을 배제할 수 있지만, 죽은 세포는 그렇지 못합니다.
- 혈구계수기는 세포 수를 세기 위한 표준 도구입니다.
- 세포 생존율을 평가하기 위해 일반적으로 Trippan blue 염색약을 사용합니다.
연구 목적
- hNSPC를 계수하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 살아있는 세포와 죽은 세포를 효과적으로 구별합니다.
- 면역화학 또는 형질전환과 같은 후속 실험을 준비하는 연구자를 돕습니다.
사용된 방법
- 위상차 혈구계수기 사용법.
- 세포 생존율 구분을 위한 트라이판 블루 염색 적용.
- 현미경 하에서의 세포 수 측정.
- 트라이판 블루와 배지 혼합액 준비.
주요 결과
- 생존 세포와 사멸 세포의 성공적인 구분.
- hNSPCs의 정확한 정량 분석.
- Trypan blue 염색제의 효과 입증.
- 신뢰할 수 있는 계수 방법으로서의 혈구계수기의 검증.
결론
- 본 프로토콜은 세포 계수에 대한 간단한 방법을 제공합니다.
- hNSPC 외에도 다양한 세포 유형에 적용 가능합니다.
- 세포 생존율을 이해하는 것은 성공적인 조직 배양 실험을 위해 필수적입니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
생존 가능한 인간 신경 줄기/전구세포(hNSPCs)의 정확한 정량화는 신경과학 약물 발견의 재현 가능한 조직 배양 워크플로우에 필수적입니다. 본 프로토콜은 신뢰할 수 있는 세포 생존율 평가 및 농도 측정을 가능하게 하여, 면역세포화학법 및 형질전환과 같은 후속 응용 단계에서 일관된 실험적 세포 접종을 지원합니다. Trypan blue와 혈구계수기를 이용한 생사 판별을 표준화함으로써, 이 방법은 초기 단계의 타겟 검증 및 분석법 개발 파이프라인에서 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 활용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 타겟 결합 및 경로 조절 연구를 위해 hNSPC를 정밀하게 파종할 수 있게 합니다.
- 운영적 가치: 생존 세포의 일관된 투입을 보장하여 세포 기반 분석의 변동성을 줄입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 분석 표준화에 필수적인 정량적이고 재현 가능한 세포 농도 데이터를 제공합니다.
- 운영적 가치: 고함량 스크리닝 포맷을 위한 세포 현탁액의 확장 가능한 준비를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 발견 단계에서 전임상 전환 단계까지 세포 투입의 일관성을 유지합니다.
- 운영적 가치: 표준화된 세포 계수 관행을 통해 교차 기능적 협업을 촉진합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 방법은 타겟 검증부터 분석 최적화 및 전임상 효능 시험에 이르기까지 신뢰할 수 있는 세포 준비를 지원함으로써 초기 발굴 연속 단계에 부합합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): hNSPC를 포함하는 표적 검증 실험에서 정확한 세포 투여량을 보장합니다.
- 스크리닝(Screening): 재현 가능한 분석 성능에 필요한 표준화되고 정량화 가능한 세포 입력물을 제공합니다.
- 분석(Analytics): 실험 조건을 정규화하는 데 사용되는 생존 세포 농도 및 총 세포 수 출력값을 생성합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 인비트로(in vitro) 발견 단계와 전임상 모델 간의 세포 처리 연속성을 지원합니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 여러 세포 유형과 프로젝트에 적용 가능한 전이 가능하고 복잡도가 낮은 역량을 나타냅니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 세포 기반 실험 입력값의 변동성을 최소화하여 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
- 운영적 가치: 실험실 및 팀 간의 재현성과 표준화를 강화합니다.
- 전략적 가치: 신뢰할 수 있는 분석 기반을 통해 더 나은 go/no-go 결정(진행 여부 결정)을 지원합니다.
- 포트폴리오 영향: 초기 효능 스크리닝에서 데이터 품질을 보장함으로써 위험 조정된 개발 진행을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 기본적인 조직 배양 기술 및 현미경 사용 능력이 필요합니다.
- 헤모사이토미터(hemacytometer)의 가용 여부와 오염 방지를 위한 적절한 세척 상태에 따라 결과가 달라집니다.
- 편향 없는 구역 선택 및 경계선 계수 규칙을 적용하기 위해 작업자에 대한 일관된 교육이 필수적입니다.
- 수동 계수의 처리량 한계로 인해, 별도의 조정 없이는 고처리량 자동화 방식에 적합하지 않습니다.
- 세포 현탁액의 대표성 있는 샘플링을 보장하기 위해 정확한 희석과 혼합이 필요합니다.
