인간 신경 줄기 세포를 Passaging

안녕하세요, 저는 Steve입니다. 저는 UC Irvine 병리학과의 Dr.Flanagan 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 인간 신경 전구 세포를 분할하는 방법을 보여드리겠습니다.

이 기술은 새로운 플라스크를 인간 fibronectin 용액으로 코팅하고, 세포 해리 완충액을 사용하여 세포를 떼어낸 후, 10% 혈청 용액으로 세포 해리 완충액을 중화시키고, 세포 현탁액을 원심 분리한 다음, 세포를 신선한 배지에 다시 현탁하여 새로운 플라스크로 옮기는 과정을 포함합니다. 저희 실험실에서는 이틀마다 배지의 절반을 교체하여 인간 신경 전구 세포를 배양하며, 약 일주일마다 1:2 비율로 분할하여 계대 배양합니다. 세포를 계대 배양할 때, 면역 화학 실험에 사용하거나 핵 효과 인자를 이용한 형질 전환을 수행하려는 경우에는 세포 수를 측정하기도 합니다.

세포를 패키징할 때 세포 해리 버퍼를 사용하는 것이 중요한데, 그 이유는 첫째로 트립신과 달리 비효소성 제품이며 세포에 훨씬 더 부드럽게 작용하기 때문입니다. 안녕하세요, 현재 조직 배양실에 나와 있습니다. 이제 합류(confluent) 상태의 인간 전구 세포 플라스크가 어떤 모습인지 보여드리기 전에, 먼저 조직 배양 준비를 하겠습니다. 우선 UV 램프를 끄고, 전등과 공기 흐름 장치를 켜겠습니다.

다음으로, 페이퍼 타월에 70% ethanol을 뿌려 후드를 닦아내어 소독하겠습니다. 후드 내부에 70% ethanol을 직접 분사하면 매우 고가인 HEPA 필터가 손상될 수 있으므로, 반드시 페이퍼 타월에 70% ethanol을 뿌려 닦아내는 것이 중요합니다. 이어서 모든 시약과 기구에 소독액을 분사하겠습니다.

마지막으로 진공 호스에 스프레이를 뿌리면 모든 준비가 끝납니다. 이제 세포들을 살펴보겠습니다. 세포들의 합쳐짐 정도(confluency)가 약 80% 정도로 보입니다.

이 세포들은 인간 태아에서 분리한 인간 신경 전구세포이며, T 25 플라스크에서 배양합니다. 약 일주일마다 1:2 비율로 계대 배양합니다. 이제 세포를 계대 배양할 준비가 되었습니다.

먼저 BD biosciences의 human fibronectin으로 4시간 동안 코팅한 새로운 T 25 플라스크를 준비하겠습니다. fibronectin 용액을 제거한 후, 세포를 플라스크로 옮기기 전에 BBS로 이 플라스크를 헹구겠습니다.

이제 37°C 인큐베이터에서 세포를 꺼내겠습니다. 여기 있습니다. 이제 human fibronectin이 코팅된 새 플라스크에서 PBS 세척 용액을 제거하겠습니다.

그리고 새 플라스크에 2 mL의 오래된 조건화 배지를 추가하겠습니다. 이제 세포를 표면에서 떼어내기 전에 PBS로 세척해야 합니다. 먼저 남아 있는 배지를 제거하고, 세포가 건조해지지 않도록 즉시 약 2 mL의 PBS를 추가하겠습니다.

플라스크 표면에서 세포를 떼어내기 위해 PBS를 제거하고 세포 해리 완충액을 넣기 전 약 2분 동안 대기하겠습니다. 이제 PBS를 제거하고, 세포가 마르지 않도록 즉시 세포 해리 완충액을 추가하겠습니다. 세포 해리 완충액 1.5 mL를 추가합니다.

PBS와는 달리, 세포 위에 직접 첨가하여 가능한 한 넓은 표면을 덮도록 하겠습니다. 따라서 버퍼를 세포 위에 천천히 첨가하면서 플라스크를 좌우로 흔들어 줍니다. 이제 세포가 표면에서 떨어지기 시작할 때까지 약 5분 정도 기다리겠습니다.

그리고 플라스크를 후드 내 실온에 그대로 두겠습니다. 여기서 보시는 것처럼, 세포들이 먼저 둥글게 변하기 시작하고 그 다음 표면에서 떨어져 나오기 시작하며, 실제로 일부 세포들이 이미 떠 있는 것을 확인하실 수 있습니다. 이때 플라스크 옆면을 가볍게 두드려 주면 세포들이 떨어져 나오는 데 도움이 됩니다.

5분이 지났으며, 보시다시피 표면에서 떨어진 세포들로 인해 용액이 매우 진해졌습니다. 이제 혈청 함유 배지 4.5 mL를 첨가하여 세포 해리 완충액의 효과를 중화시키겠습니다. 10% 열불활성화 태아 송아지 혈청이 포함된 DMEM/F12 배지를 사용하며, 부착된 세포가 남지 않도록 플라스크 표면에 직접 첨가하겠습니다.

다음으로 피펫팅을 부드럽게 반복하여 남아 있는 세포들을 모두 분리하겠습니다. 그런 다음 세포 용액을 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 그리고 1,000 RPM에서 1분 동안 원심분리하겠습니다.

세포 원심분리가 완료되어 여기 아름다운 세포 펠렛(cell pallet)이 형성되었습니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 매우 조심스럽게 혈청 배지를 제거하겠습니다. 그 다음, 4 mL의 배지로 펠렛을 재부유시키겠습니다.

이제 세포 덩어리가 남지 않도록 펠렛을 재부유시켜, 용액이 균질해지고 덩어리가 없는 상태가 되도록 하겠습니다. 1:2 분할 배양을 수행하므로, 4 mL 중 2 mL를 취해 이미 2 mL의 조건 배지가 들어 있는 새 플라스크로 옮기겠습니다. 마지막으로 플라스크에 세포 종류, 계대 횟수 및 날짜를 표기하겠습니다.

이것은 30분 전에 계대 배양한 세포들의 모습입니다. 보시다시피, 대부분의 세포가 표면에 부착되어 돌기를 뻗기 시작했습니다. 이것으로 모두 마치겠습니다.

이제 계수를 시작할 준비가 되었습니다.