iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

다음 실험의 전반적인 목표는 개별 뉴클레오타이드 해상도로 RNA 결합 단백질의 결합 부위에 대한 전사체 전체 맵을 얻는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 살아있는 세포에 UV 조사를 하여 생체 내(in vivo)에서 단백질과 RNA를 공유 결합으로 교차 결합시킴으로써 달성됩니다. 교차 결합된 RNA 단편을 회수하기 위해 RNA 결합 단백질을 엄격한 조건에서 면역 정제합니다.

다음 역전사 과정에서 생성되는 cDNA는 대개 결합된 펩타이드에서 절단되며, 이를 통해 RNA 내의 교차 결합 위치에 대한 정보가 보존됩니다. cDNA 라이브러리의 고처리량 시퀀싱을 기반으로 전사체 내의 모든 결합 부위를 보여주는 결과가 도출됩니다. 이 방법은 서로 다른 RNA 결합 단백질의 상호작용이 RNA 프로세싱을 어떻게 조절하는지와 같은 RNA 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질-RNA 상호작용의 전사체 전반 지도에 대한 성능과 해상도를 모두 높일 수 있다는 점입니다. 이제 조직 배양 세포의 UV 교차 결합 절차를 시작해 보겠습니다.

Healer cell이 배양된 10 centimeter 플레이트에서 배지를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 6 mL를 첨가하고 플레이트를 얼음에 둡니다. 플레이트 한 개로 세 번의 실험이 가능합니다.

뚜껑을 제거하고 세포에 조사를 실시합니다. 254 nm에서 150 mJ/cm²로 조사한 후, 셀 리프터(cell lifter)를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어내어 수확합니다. 세포 침전물을 만들기 위해 세포 현탁액 2 mL씩을 3개의 마이크로 튜브에 각각 옮깁니다. 4 °C에서 최고 속도로 10초 동안 원심분리합니다.

그런 다음 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 드라이아이스로 급속 냉동하여 사용 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. 새로운 마이크로 튜브에 실험당 100 µL의 protein A dyna beads를 넣습니다. 마우스 또는 염소 항체를 사용하는 경우, protein G dyna beads를 사용하십시오.

동봉된 서면 프로토콜에 기재된 lysis buffer로 비즈를 두 번 세척합니다. 2~10 µg의 항체가 포함된 100 µL의 lysis Buffer에 비즈를 다시 현탁합니다. 튜브를 상온에서 30~60분 동안 회전시킵니다.

그런 다음 900 µL의 용해 버퍼로 비드를 3회 세척하고, 다음 단계를 진행할 때까지 마지막 세척액에 비드를 그대로 둡니다. 면역침강을 위해 얼음 위에서 Thor 세포 펠렛을 준비합니다. 세포 펠렛을 1 mL의 용해 버퍼에 재현탁하여 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다.

RNase One을 1:500으로 희석하여 준비합니다. 그다음 cell Lysate에 10 µL의 희석액과 2 µL의 Turbo DNase를 함께 첨가합니다. 시료를 37 °C에서 1,100 rpm으로 흔들어주며 정확히 3분 동안 반응시킨 후, 즉시 얼음에 옮겨 보관합니다.

그 후, 용해물을 제거하기 위해 샘플을 4 °C, 22,000 ×g에서 20분 동안 원심분리합니다. 비즈를 면역 침전시키기 위해 펠렛과 함께 약 50 µL의 용해물을 남겨두고 상층액을 조심스럽게 수집합니다. 세척 버퍼를 제거한 다음, 준비된 세포 용해물을 첨가합니다. 샘플을 4 °C에서 2시간 동안 회전시킵니다.

SUP 시약을 제거하고, 동봉된 서면 프로토콜에 명시된 high salt buffer 900 microliters로 비즈를 두 번 세척합니다. 마지막으로 wash buffer 900 microliters로 비즈를 두 번 세척합니다. 그 다음 RNA 3' 말단의 탈인산화 및 링커 결합 단계를 진행합니다.

플렉시글라스 차단막 뒤에서 RNA 5' 말단을 표지합니다. 링커 결합 반응의 마지막 세척 단계에서 상층액을 제거하고, 8 µL의 hot PNK mix에 비드를 재현탁합니다. 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.

가열된 PNK 믹스를 제거하고 재사용하십시오. 비드를 1× 새 페이지 로딩 버퍼 20 µL에 현탁합니다. 그런 다음 샘플을 서모 믹서(thermo mixer)에서 70 °C로 10분 동안 배양합니다.

빈 비드를 침전시키기 위해 샘플을 즉시 자석 위에 놓으십시오. 제조사의 지침에 따라 샘플을 4~12%의 새 page. Biss gel에 로딩하십시오.

또한, 5 µL의 미리 염색된 단백질 크기 마커를 로딩하십시오. 180 V에서 50분 동안 겔을 전기영동합니다. 제조사의 지침에 따라 NOVA wet transfer 장치를 사용하여 겔의 단백질-RNA 복합체를 니트로셀룰로스 막으로 전이시키십시오.

트랜스퍼 후, membrane을 PBS 버퍼로 헹굽니다. 그런 다음 Saran wrap으로 감싸 -80 °C에서 필름에 노출시킵니다. 노출 시간은 30분, 1시간 및 overnight로 수행합니다.

다음으로, 저분자 RNA(low RNAs)로부터 단백질-RNA 복합체에 해당하는 막 영역을 분리합니다. 이때 자동 방사선 사진(auto radiograph)을 마스크로 사용하여 실험하십시오. Proteinase K 소화와 페놀-클로로포름 추출을 통해 막에서 RNA를 회수합니다.

AYP 프라이머 중 하나를 사용하여 RNA를 역전사한 후 cDNA를 젤 정제합니다. cDNA 샘플 6 µL를 2배 TBE urea 로딩 버퍼 6 µL와 혼합합니다. 샘플을 젤에 로딩하기 직전에 수행합니다.

시료를 80°C에서 3분 동안 가열합니다. 그다음 저분자량 마커와 함께 시료를 precast 6% TBE urea gel에 로딩합니다. 제조사의 지침에 따라 180V에서 40분 동안 전기영동을 수행하며, 상단 염색약과 플라스틱 젤 지지대의 표시선을 기준으로 절단 부위를 안내합니다.

120~200 뉴클레오타이드, 85~120 뉴클레오타이드 및 70~85 뉴클레오타이드 크기의 밴드 세 개를 절단합니다. arc lip 프라이머와 L three 서열을 합하면 clip 서열의 52 뉴클레오타이드에 해당한다는 점에 유의하십시오. 400 µL의 te를 추가하고 겔 조각을 작게 부숩니다.

1 mL 시린지 플런저를 사용하여 겔 조각을 37 °C에서 1,100 rpm으로 2시간 동안 흔들어 배양합니다. 1 cm 유리 프리필터 2개를 CoStar spinx 컬럼에 넣습니다. 샘플의 액체 부분을 컬럼로 옮긴 후, 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 1.5 mL 튜브에 수집합니다.

0.5 µL의 glyco blue와 pH 5.5의 sodium acetate 40 µL를 첨가합니다. 그런 다음 샘플을 혼합합니다. 100% ethanol 1 mL를 첨가합니다.

다시 혼합하고 -20 °C에서 하룻밤 동안 샘플을 침전시킵니다. 마지막으로, CD NA 분자를 원형화하여 5' 말단에 어댑터 영역을 부착합니다. 다음으로, 아이클립(eye clip) 라이브러리 시퀀싱 전의 동봉된 서면 프로토콜에 따라 다시 선형화하고 PCR 증폭을 수행하며, 실험의 성공 여부는 두 단계에서 모니터링할 수 있습니다.

막 전이 후 단백질-RNA 복합체의 자동 방사선 사진과 PCR 생성물의 겔 이미지에서, RNA 함량이 낮은 샘플의 자동 방사선 사진에서는 단백질 분자량 위쪽으로 확산된 방사능이 관찰되어야 하며, RNA 함량이 높은 샘플의 경우 이 방사능이 단백질 분자량에 더 가깝게 집중되어 나타납니다. 면역침전 시 항체를 사용하지 않으면 신호가 검출되지 않아야 합니다.

면역침전의 특이성을 확인하기 위한 추가적인 중요 대조군으로는 UV 조사를 생략하거나 표적 단백질을 발현하지 않는 세포를 사용하는 방법이 있습니다. PCR 산물의 겔 이미지는 CD NA 분획에 해당하는 크기 범위가 나타나야 합니다. PCR 프라이머인 P three Celexa와 P five Celexa가 CD NA의 크기에 76개 뉴클레오타이드를 추가한다는 점에 유의하십시오. 면역침전 과정에서 항체를 사용하지 않은 경우, 그에 해당하는 PCR 산물이 검출되지 않아야 합니다.

이 절차를 수행할 때, 64가지의 각 단계가 매우 중요하며 100% 정확하게 수행되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. ICL 데이터는 전사체 전반의 기능 분석과 계산적으로 통합될 수 있습니다. 이를 통해 예를 들어, RNA 프로세싱의 위치 의존적 조절에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

전산 데이터 분석에 대해서는 Nicholas KA European Bioinformatics Institute 및 Liana 대학의 bla zupan과 공동으로 진행한 최근 논문들을 참고하시기 바랍니다. 이제 직접 실험을 시작하실 차례입니다. 즐겁게 실험하시길 바랍니다.