비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

본 프로토콜은 무표지 세포 분리 및 분석을 위한 수용체 패턴 기판 설계를 용이하게 하기 위해, 비대칭 수용체 패턴 상에서의 세포 롤링 궤적을 관찰하고 분석합니다. 먼저 금 기판 위에 PEG 분자를 마이크로 컨택 프린팅하여 자기 조립 단분자층의 교차 패턴을 생성한 후, P-selectin 수용체로 기판의 빈 공간을 채웁니다. 다음으로, 해당 기판을 유체 챔버에 장착합니다. 챔버 내부로 HL 60 세포를 흘려줍니다.

P selectin 패턴 위에서 HL 60 세포의 롤링 상호작용 이미지 시퀀스를 기록하고, 비디오에서 변환된 이미지를 분석하십시오. MATLAB 프로그램을 사용하여 평면, 영역 및 가장자리에서의 롤링 세포 가장자리 추적 경로, 길이 및 롤링 속도를 구할 수 있습니다. 이 방법은 전단 흐름 하에서 비대칭 수용체 패턴 위로 HL 60 세포가 어떻게 이동하는지에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

이는 수용체 패턴상에서 세포의 궤적을 관찰함으로써 세포 표면 상호작용을 정량화하고 세포를 직접 분석하는 데 적용될 수 있습니다. 또한 세포 분리를 위한 마이크로 푸팅(micro footing) 장치 설계에도 활용 가능합니다. 금 기판 위에 PEG 분자의 자기 조립 단분자층이 교대로 나타나는 패턴을 생성하기 위해 마이크로 접촉 인쇄법이 사용됩니다.

먼저 PDMS 스탬프에 5 mM PEG 에탄올 용액을 도포합니다. 표면을 20분 동안 건조시킵니다. 스탬프를 금 표면에 40초 동안 부드럽게 올려놓고, 금 표면과 스탬프가 잘 접촉되었는지 확인합니다.

과도한 압력은 필요하지 않습니다. 표면을 ethanol로 헹구고 질소 기류 하에서 건조합니다. 이제 perfusion chamber를 사용하여, 기질을 15 µg/mL P selectin 용액과 함께 상온에서 3시간 동안 배양하여 나머지 영역에 P selectin 패턴을 형성하고, chamber를 헹군 다음, 비특이적 상호작용을 차단하기 위해 1 mg/mL BSA로 표면을 1시간 동안 backfill 합니다.

세포 롤링 실험을 수행하기 전, DPBS 버퍼로 표면을 헹굽니다. 플로우 챔버를 조립한 후, 수용체 패턴의 경사각이 10도인 직사각형 플로우 챔버 내의 패턴 표면 위로 10⁵ cells/mL 농도의 HL 60 세포 현탁액을 흘려줍니다.

실온 24.5 °C에서 진행합니다. 시린지 펌프를 조절하여 75 µL/min의 유량을 생성하며, 이에 해당하는 층류 전단 응력은 0.5 dynes/cm²로 설정합니다. 이제 도립 현미경과 장착된 카메라를 사용하여 HL 60의 롤링(rolling) 현상을 기록합니다.

접착성 p-selectin 및 기질과의 상호작용. 4배율 대물렌즈를 사용하여 초당 1프레임의 속도로 300초 동안 촬영한다. 세 번의 독립적인 실험을 수행한다.

데이터는 각 실험에서 얻은 평균값의 평균과 표준편차로 나타내십시오. HL 60.Rolling 영상에서 변환한 현미경 이미지입니다. 접착성 p-selectin 및 기판과의 상호작용은 각각 p-selectin 수용체 영역에 해당하는 밝은 부분과 PEG 영역에 해당하는 어두운 부분으로 나타납니다.

여기서는 맞춤형 MATLAB 프로그램을 사용하여 트랙을 구분하였습니다. 가장자리 경사각은 10도였으며, 전단 응력은 0.5 dines per centimeter squared였습니다. 가장자리 트랙 길이의 분포, 가장자리 트랙 길이의 평균값뿐만 아니라 밴드의 가장자리와 내부에서의 회전 속도인 VE 및 VP에 대해 추가 분석을 수행하였습니다.

이 영상을 시청한 후에는 비대칭 수용체 패턴 상에서 세포 궤적을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.