타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

본 절차의 전반적인 목표는 박동성 바이오리액터 시스템을 사용하여 생물학적 기반의 혈관 이식편을 제작하는 것입니다. 이는 세포가 성장할 수 있는 PGA 메쉬로 생분해성 스캐폴드를 제작하고 이를 바이오리액터 챔버 내에 조립함으로써 수행됩니다. 그 다음 스캐폴드에 평활근 세포를 배치하고, 공기 및 공급 튜브가 연결된 덮개로 바이오리액터 챔버를 밀봉합니다.

그 후 바이오리액터를 유동 시스템에 연결하여 바이오리액터 내의 혈관에 맥동성 흐름을 제공합니다. 리액터 내에서 세포는 면역화학적, 생화학적 및 기계적 테스트를 통과하는 혈관으로 성장합니다. 이 기술은 동맥 우회술을 위한 이식 가능한 소구경 혈관 이식편을 재생하는 유망한 접근 방식이므로, 관상동맥 질환 치료에까지 그 활용 가능성이 확장됩니다.

이 방법은 혈관 공학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 주기적인 생리학적 힘을 받는 다른 장기 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람은 어려움을 겪을 수 있습니다. 기술을 완전히 숙달하기 위해서는 많은 연습이 필요합니다.

우리는 공학적 구조물을 재생하기 위해 생리학적 기계적 자극을 가하는 것이 중요하다는 점을 깨달았을 때 처음으로 이 접근 방식에 대한 아이디어를 얻었습니다. 바이오리액터 싱(sing) 공정은 단계가 많아 익히기 어렵고 상세한 시연을 통해서만 습득할 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선, 증류수를 사용하여 내경 3 mm의 실리콘 튜브를 30 cm 길이로 절단하여 세척한 후 자연 건조시킵니다.

가위와 지혈 겸자를 사용하여 각 튜브 조각당 1.1 centimeter by 8 centimeter 크기의 PGA 메쉬 섹션을 절단합니다. Dexon 6.0 봉합사로 PGA 메쉬를 튜브에 고정하기 위해 외과적 매듭을 세 번 묶고 지혈 겸자로 단일 봉합을 수행하면, 고정된 메쉬가 PGA 스캐폴드가 됩니다. 스캐폴드를 1 molar 수산화나트륨에 1~2분 동안 담근 후, 증류수에 2분씩 세 번 담가 세척합니다. 세척 단계 사이마다 가볍게 닦아 물기를 제거하고, 세 번째 세척 후에는 후드 내에서 15분 동안 자연 건조시킵니다.

건조시킨 후, 메쉬의 양쪽 끝에 1 cm 길이의 Dacron 커프를 세 바늘로 봉합합니다. 튜브가 2~3 mm 정도 겹치게 하고 튜브에 구멍이 나지 않도록 주의하십시오. 본 프로토콜의 후속 단계를 위해 봉합사 약 15 cm를 여유 있게 남겨두어야 합니다.

모든 바이오리액터 구성 요소와 도구는 사전에 오토클레이브 멸균합니다. 바이오리액터 배양을 시작하기 전날, 바이오리액터를 부분적으로 조립해야 하며, 스캐폴드, 메쉬, 실리콘 튜브, 수술 도구 및 바이오리액터 길이보다 긴 가는 와이어 등의 바이오리액터 구성 요소를 70% ethanol 용액에 최소 30분 동안 담가둡니다. 와이어를 사용하여 실리콘 튜브를 리액터의 사이드암으로 끌어당겨 통과시킵니다.

이제 바이오리액터를 꺼내고, 플레어 처리된 유리 입구 위에 Dacron 커프를 고정하여 내부에 PGA 스캐폴드를 부착합니다. 남은 봉합사로 각 커프를 묶어 고정합니다. 다음으로, 커넥터를 사용하여 스캐폴드 한쪽의 실리콘 튜브를 바이오리액터 암 한 쌍에 연결하고, 스캐폴드 반대편의 튜브를 나머지 두 개의 암에 연결합니다.

커넥터가 설치되면, 이를 사이드암에서 빼내고 바이오리액터 내부를 에탄올로 세척하십시오. 리액터를 각 측면당 10분 동안 담가 두십시오. 바이오리액터를 페트리 접시 위에 올려놓고 조직 배양액으로 세척하십시오.

물을 흘려보내 세척합니다. 피펫을 사용하여 메쉬와 튜브 내부까지 충분히 세척하십시오. 이제 추후 사용을 위해 멸균된 마그네틱 바를 반응기에 넣고, 이때부터는 후드 내에서 블로어는 켜고 UV 램프는 끈 상태로 장치를 하룻밤 동안 건조하십시오.

오염의 원인이 될 수 있으므로 반응기 위로 몸을 기울이지 마십시오. 설정 과정에서 모든 커넥터는 알코올로 깨끗이 닦아야 합니다. 연결하기 전, 많은 조인트 부위를 파라필름으로 보강하며, 파라필름은 적용 전 70% ethanol에 적셔야 합니다. 따라서 두 가지 모두 충분히 준비하십시오.

예방 조치로, 내부의 PGA scaffold를 오염물질로부터 보호하기 위해 각 바이오리액터 개구부 위에 멸균 페트리 접시를 놓아 준비합니다. 이제 바이오리액터의 세 번째 미사용 암에 주입 포트를 부착하여 설정을 시작합니다. 다음으로, IV 백을 유량 시스템에 연결합니다.

walrus 튜빙 세트를 사용하여, Y 분기점과 최대한 가까운 곳에서 파란색 끝단을 묶고 튜브를 클램프로 고정합니다. 빨간색 튜빙을 IV 백의 반대쪽 끝에 연결합니다. 그런 다음 흰색 튜브를 유체 흐름 시스템의 한쪽에 연결합니다.

유량 시스템에 3방향 스톱콕(three-way stop cock)을 삽입합니다. 압력 트랜스듀서 튜브의 한쪽 끝을 스톱콕에 연결하고, 다른 쪽 끝을 IV 백의 중앙 개구부에 연결합니다. 이제 유량 시스템을 부분적으로 채우고 누출 여부를 확인하기 위해, IV 백에 350 milliliters의 PBS와 1% fungi zone을 추가합니다.

흐름 시스템에 연결하기 전 또는 후에 60 milliliter 주사기를 사용하여, 스탑콕을 조절해 PBS의 흐름 방향을 제어하고 백을 짜서 시스템을 세척합니다. 이 단계는 세포 안착 전이나 후 어느 때든 수행할 수 있습니다. 이제 바이오리액터에 세포를 안착시킬 수 있습니다.

본 예시에서는, 약 1개의 confluence 상태인 T 75 플라스크 분량에 해당하는 8백만 개의 SM 세포를 1.25 milliliters의 배지에 현탁하여, Dacron 접합부에서 Dacron 접합부까지 PGA 스캐폴드 위에 균일하게 떨어뜨려 줍니다. 세포를 첨가한 후, 알코올을 사용하여 바이오리액터의 테두리를 깨끗이 닦아냅니다. 리액터 위에서 몸을 기울이는 행동은 피하십시오.

다음으로, 실리콘 마개 뚜껑을 조심스럽게 조립하십시오. 오토클레이브 백에서 뚜껑을 꺼낼 때나 이후의 부착 단계 동안 뚜껑 바닥면이 외부로 노출되지 않도록 주의하십시오. 먼저, 수커넥터(male connector) 부분에서 주입구와 공급 튜브를 연결하십시오.

둘째, 세 개의 에어포트 각각에 PTFE 0.20 micron 필터를 부착합니다. 셋째, 주입구를 밀봉합니다. 조립된 실리콘 마개 덮개를 유리 바이오리액터에 삽입합니다.

공급 튜브가 안착된 PGA 스캐폴드에 닿지 않도록 주의하십시오. 그 다음 파라폼으로 밀봉합니다. 이제 바이오리액터를 유동 시스템에 연결하고, 바이오리액터와 유동 시스템을 37 °C 인큐베이터 안에 넣으십시오.

25분에서 30분 동안 반응기를 옆으로 눕힌 상태로 5분마다 회전시켜야 합니다. 다음으로, 인큐베이터 내에 있는 상태에서 펌프를 통해 피딩 튜브로 바이오리액터 챔버에 4-10 배양액 400 milliliters를 채웁니다. 이제 파동 펌핑 없이 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 세포가 파종된 스캐폴드를 6~7일 동안 배양합니다.

펌프를 켜기 전 이 기간 동안에는 배지 교체나 비타민 C 보충이 필요하지 않으며, 튜빙에 누출이나 꼬임이 없는지 점검하십시오. 그런 다음 펌프의 속도를 조절하여 압력 범위를 -30에서 270 mmHg 사이로 유지하십시오. 배양 기간 내내 매일 이 압력을 모니터링하고 유지하십시오.

배지 교체 및 아스코르브산 보충은 스캐폴드가 맥동 펌핑을 통해 성장하는 동안 주 2회 수행해야 하며, 신선한 배지를 먼저 공급하기 위해 배지 교체 및 폐배지 제거용 공급 리드에 주입구와 PTFE 필터를 부착합니다. 다음으로, 공급 튜브를 이방향 펌프에 단단히 고정하고 한쪽 끝은 바이오리액터의 공급 포트에, 다른 쪽 끝은 공급 리드에 삽입합니다. 이제 200 milliliters의 배지를 천천히 펌핑하여 배출합니다.

펌프 속도를 점진적으로 높입니다. 그런 다음 새로운 공급 튜브를 연결하고 200 milliliters의 신선한 배지를 천천히 펌핑하기 시작합니다. 반응기에 아스코르브산을 첨가하려면, 멸균된 30 milliliter 주사기를 사용하여 배지 25 milliliters를 제거하십시오.

멸균된 ascorbic acid 용액 5 mL를 첨가한 후 25 mL를 다시 채웁니다. 공학적으로 제작된 혈관은 8주간의 배양 후 불투명하게 보이며 벽 두께는 약 250 µm에 도달합니다. 박동 조건 하에서 공학적 혈관의 hematoxylin, eosin 염색 결과는 시간 경과 및 박동에 따라 조직 형태가 변화함을 보여줍니다.

혈관의 내강 측은 Masson's trichrome 염색에서 L로 표시됩니다. 콜라겐의 경우, 4주간 펄스 처리를 한 혈관이 비펄스 대조군보다 더 많은 콜라겐을 보유하고 있음을 보여줍니다. 흰색 화살표는 12주 차 혈관에 남아 있는 PGA 파편을 가리킵니다. 면역화학적 분석 결과, 초기 평활근 마커인 alpha actin, 중간 평활근 마커인 calponin 1, 그리고 후기 평활근 마커인 myosin heavy chain의 발현이 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 7~8시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행하는 동안, 본 지침에 따라 모든 과정을 최대한 깨끗하고 멸균된 상태로 진행하는 것이 중요합니다. 생체 내(in vivo) 연구 중 공학적 혈관의 유지에 있어 내강 표면 수정의 중요성과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 공학적 혈관의 내강을 수정하는 것과 같은 다른 방법들을 개발 후에 수행할 수 있습니다.

이 기술은 조직 공학, 특히 혈관 공학 분야의 연구자들이 동물 모델에서 관상동맥 질환을 치료할 수 있는 잠재적 수단을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 동적 포스탈 배양(dynamic postal culture)을 통해 이식 가능한 공학적 혈관 이식편을 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 수산화나트륨을 사용하는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 보안경과 실험복 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.