탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

이 영상에서는 동맥 조직 공학을 위해 다공성 관형 스캐폴드를 제작하고 이를 동적 기계적 자극에 노출시키는 방법을 보여줍니다. 우선 생분해성 엘라스토머와 용융 접합법을 사용하여 스캐폴드를 제작합니다. 그 후 세포 파종을 위해 스캐폴드를 준비하고 이를 바이오리액터 시스템에 조립합니다.

바이오리액터 내의 혈관 평활근 세포를 스캐폴드에 파종하여 배양합니다. 몇 주 후, 조직을 수확하여 주사 전자 현미경, H&E 염색 및 엘라스틴 자가형광을 이용하여 분석합니다. 그 결과, 평활근은 다층 구조를 형성하며 수직 방향으로 배열됩니다.

입자 제거법과 유사한 이 기술의 주요 장점은 유리 몰드를 사용하여 다공성 관형 지지체와 히알루론산을 제작할 수 있다는 것입니다. 몰드를 제거하면 지지체가 완성되며, 지지체 몰드는 유리관 조각으로 준비합니다. 관을 홀더에 고정하고 전날 준비한 히알루론산 용액을 관 안에 붓습니다.

히알루론산이 내벽을 따라 천천히 흘러내립니다. 용액이 몰드 바닥에 도달하면 몰드를 뒤집어 줍니다. 몰드 내벽에 용액이 고르게 코팅될 때까지 이 단계를 반복합니다.

코팅 후, 준비된 모든 유리 몰드를 진공 오븐에서 37 °C로 24시간 동안 건조합니다. 일반적으로 유리 몰드가 건조되는 동안 4개의 몰드를 동시에 준비합니다. 염 입자 주입물을 준비하기 위해, SVE 염 입자를 25에서 32 µm 크기로 분쇄합니다.

다음 날, 준비된 유리 몰드 맨드릴, PTFE 튜빙, 열수축 슬리브 및 PTFE 링을 조립합니다. 먼저, 맨드릴을 65 millimeter 길이의 PTFE 튜빙에 넣고 120 degrees Celsius에서 5분 동안 가열합니다. PTFE를 수축시키는 동안 하이브리다이제이션 인큐베이터를 37 degrees Celsius로 최소 30분 동안 예열해 둡니다.

튜브가 맨드릴을 감싸면, 열수축 슬리브를 맨드릴 위로 밀어 넣어 자유롭게 움직이게 합니다. 그다음 맨드릴을 유리 몰드 안에 넣고 맨드릴 하단에 A-P-T-F-E 링을 부착합니다. PTFE 링이 유리 몰드 바닥에 밀착되었는지 확인하십시오.

다음으로, 스패튤라와 실리콘 고무 깔때기를 사용하여 유리 몰드에 염 입자 죽을 넣습니다. 그런 다음 입자가 고르게 분포되도록 스패튤라로 몰드를 가볍게 두드리고 넘친 소금을 긁어냅니다. 이제 예열된 인큐베이터의 전원을 끄고 소금이 채워진 몰드를 빠르게 넣습니다. 이후 30분 동안 소금이 융합되며, 그 후 진공 오븐에서 37 °C로 24시간 동안 몰드를 건조시킵니다.

냉각 후 다음 날, PTFE 링을 고정한 상태에서 스테인리스 스틸 맨드릴을 밀어내어 몰드에서 제거합니다. 필요한 경우 니들 노즈 플라이어를 사용하십시오. 그런 다음 몰드 바닥에서 PTFE 링을 제거합니다.

다음으로, 몰드를 가열하여 슬리브를 수축시킨 후, 수축된 슬리브를 몰드에서 제거합니다. 몰드는 다음 사용 시까지 식힌 후 후드 내 데시케이터에 보관합니다. 스포이드를 사용하여 유리 몰드를 45도 각도로 기울인 뒤, 몰드를 천천히 회전시키면서 내부 루멘에 PGS 용액을 떨어뜨립니다.

PGS 용액이 몰드의 벽면을 따라 흘러내리는지 확인하십시오. 건조한 부분이 있으면 PGS를 더 추가하십시오. 이제 흄 후드 내에서 THF를 최소 30분 동안 증발시키십시오. THF가 모두 증발하면, 진공 오븐에서 몰드를 경화시키십시오.

하루 동안 경화시킨 후, 몰드를 상온으로 식히고 24 °C의 탈이온수에 수직으로 천천히 담급니다. 너무 빠르게 기울이면 기포가 발생하여 스캐폴드가 찢어질 수 있습니다. 몰드를 워터 배스로 조심스럽게 옮깁니다.

실리콘 튜브를 사용하여 비스듬하게 배치하고, 히알루론산이 한 시간 동안 용해되도록 둡니다. 한 시간이 지난 후에도 히알루론산이 몰드에서 분리되지 않았다면, 몰드를 담근 상태에서 스패튤라를 사용하여 히알루론산을 양 끝에서 천천히 밀어낸 다음, 몰드를 천천히 흔듭니다. 이제 유리 몰드 내부에서 스캐폴드가 움직이지 않았는지 확인하고, 움직였다면 포셉으로 스캐폴드를 천천히 당겨 몰드에서 분리합니다.

다음으로, 섬세한 스캐폴드를 완만하게 교반하는 탈이온수 배스로 조심스럽게 옮겨 염 입자를 침출시킵니다. 이 과정은 최소 3일이 소요되며, 매일 물을 교체해주어야 합니다. 염이 모두 침출되면, 각 스캐폴드를 탈이온수가 채워진 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮긴 후 드라이아이스 박스에서 1시간 동안 동결시킵니다. 동결된 원심분리 튜브의 캡을 열어 동결건조기에 넣고 3일 동안 건조합니다.

동결 건조가 완료되면, 사용 전까지 지지체(scaffold)를 데시케이터에 보관하십시오. 먼저 지지체를 25~30 mm 길이로 자릅니다. 다음으로, 각 실리콘 고무 마개의 중앙 구멍에 PTFE 튜빙을 끼워 두 개의 마개를 준비합니다.

그런 다음 수축 튜브(hs ring)를 1.5mm 길이로 자르고, 자른 튜브를 지지체(scaffold)의 한쪽 끝에 끼웁니다. 스토퍼에 연결된 PTFE 튜브 하나를 지지체의 동일한 끝부분으로 밀어 넣되, 지지체가 튜빙에 단단히 연결될 수 있도록 수축 튜브 아래로 약간 겹치게 밀어 넣은 후, 오븐에서 수축 튜브를 수축시키고 조립체가 상온으로 식을 때까지 기다립니다. 이제 바이오리액터 챔버 역할을 하는 50mm 폴리카보네이트 튜브를 지지체 위로 미끄러뜨려 끼우고 실리콘 고무 스토퍼의 내면에서 고정합니다.

이전과 마찬가지로, 다른 PTFE 튜브와 스토퍼를 hs 링으로 스캐폴드의 반대쪽 끝에 고정하여 챔버를 완성합니다. 두 번째 스토퍼는 폴리카보네이트 튜브의 반대쪽 끝에 부착합니다. 다음으로, 스토퍼의 외면을 두 개의 알루미늄 합금 플레이트에 부착합니다.

각 플레이트의 측면 구멍에 나사산 막대 두 개를 끼우고 손나사로 플레이트를 고정합니다. 스캐폴드를 바이오리액터에 부착합니다. 이제 두 개의 hs 링 사이의 거리인 각 스캐폴드의 가시 길이를 측정하고, 내부 표면적을 계산합니다.

세포 파종을 위해, 오토클레이브를 사용하여 호일로 개별 포장한 챔버들과 바이오리액터 유닛의 각 부품을 멸균합니다. 멸균이 완료되면, 세포 배양 후드 내에서 바이오리액터를 조립합니다.

연동 펌프를 사용하여 유체 회로에서 분당 1mm의 속도로 일련의 관류를 수행하여 스캐폴드를 전처리하고 세척합니다. 먼저 70% ethanol, 50% ethanol, 이어서 25% ethanol로 각각 1시간씩 세척합니다. 세 번의 ethanol 세척 후에는 PBS로 2시간 동안 세척합니다.

마지막으로, 바이오리액터에 SMC 배양액을 24시간 동안 관류시키면 세포 파종 및 실험 준비가 완료됩니다. 이제 함께 제공된 원고의 지침에 따라, 제곱센티미터당 200만 개의 세포를 바이오리액터에 파종하고, 이후 21일 동안 튜브 내 배지를 교체하며 펌프 속도를 조정합니다. 점진적으로 구조물 내의 압력은 배양 첫날 약 4 mmHg에서 배양 2주 후 100 mmHg 이상으로 증가하며, 배양 3주 후에는 함께 제공된 원고에 명시된 대로 세포를 수확하여 분석을 준비합니다.

이러한 관형 PGS 지지체는 솔트 퓨전(salt fusion)법으로 제작되었습니다. 주사전자현미경 분석 결과, 모든 지지체는 균일한 벽 두께를 가졌으며 단면에서 부분적인 결함이 발견되지 않았습니다. 모든 지지체의 내강 표면에서 무작위로 분포된 거대 기공과 미세 기공이 관찰되었습니다.

세포 배양 후, 다층의 SMC는 유체 흐름 방향에 수직인 방향으로 성장했습니다. 또한, 세포와 DCM 단백질이 모든 PGS 구조체의 내강을 완전히 덮었습니다. 엘라스틴 자가형광 결과, 구조체의 내강 표면에서 원주 방향으로 조직된 탄성 섬유가 관찰되었습니다.

이 영상을 시청한 후, 다공성 튜브형 지지체를 제작하고, 세포를 관찰하며, 사전 설계된 바이오리액터를 사용하여 지지체를 배양하는 방법을 이해하게 될 것입니다.