솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스

본 절차는 수명, 번식 및 대사에 미치는 영향을 연구하기 위해 sea elegance의 표준 abased plate에서 식이 제한을 수행합니다. 이는 먼저 먹이원으로 사용될 박테리아의 농도를 정확하게 측정함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 박테리아 배양액을 적절한 농도로 희석하는 것입니다.

그 다음, 사멸시킨 박테리아를 포함한 기반 SDR 플레이트를 준비합니다. 마지막으로, 연령이 동기화된 웜 집단을 사용하여 SDR 실험을 설정합니다. 자손 생산 및 수명 측정 결과는 자손 생산의 지연 및 감소와 더불어 평균 수명의 증가를 나타낼 수 있습니다.

AZA 배지 내의 Dian과 같은 60가지 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 대부분의 warm 실험실에서 식이 제한 실험에 사용하는 표준 고체 AGA 기반 플레이트에서 모든 실험이 수행된다는 점입니다. C. elegans를 위해 먹이원으로 사용되는 각 박테리아 균주별로 별도의 검정 곡선을 설정하십시오. LB agar의 신선한 스트리킹 플레이트에서 e coli OP 50 박테리아의 단일 콜로니를 선택하여 37°C 쉐이커에서 3mL의 액체 LB broth 배양액에 접종하고 하룻밤 동안 배양하십시오. 하룻밤 배양한 배양액의 2배 연속 희석액을 준비하십시오.

그런 다음 분광광도계를 사용하여 각 희석액의 흡광도를 600 nanometers에서 3회 반복 측정합니다. 각 세균 현탁액을 추가로 100만 배 희석한 후, 각 희석 단계의 세균 현탁액 0.4 milliliters를 100 millimeter lb agri 플레이트에 균일하게 접종하고 37 degrees Celsius에서 18~24시간 동안 배양합니다. 각 플레이트에서 성장한 세균 콜로니 수를 측정하여 각 샘플의 milliliters당 콜로니 형성 단위(colony forming units per milliliter)를 계산합니다.

이제 세균 농도에 따른 OD 600을 도식화하고, 측정된 OD 600 값과 OP 50 세균 농도 사이의 관계를 규명하기 위해 선형 회귀 분석을 수행합니다. 본 방법에서는 ad lido feeding 조건으로 1 × 10¹¹ CFUs/mL의 세균 농도를, 최적의 DR feeding 조건으로는 1 × 10⁸ CFU/mL를 사용합니다. 다만, 완전한 용량 의존적 관계를 확립하기 위해서는 4~6가지의 서로 다른 세균 농도가 필요할 수 있습니다.

SDR 및 그 반응을 위해, e coli OP 50 박테리아의 단일 콜로니를 3 mL의 액체 LB 배지에 접종하여 37 °C 진탕 배양기에서 6~8시간 동안 배양하여 접종원을 준비합니다. 필요한 경우, OP 50 배양액을 500 mL의 LB 배지가 담긴 새 플라스크로 옮겨 박테리아가 포화 상태에 도달할 때까지 하룻밤 동안 배양합니다.

OD 600에서 흡광도를 측정할 수 있도록 OP 50 배양액을 적절히 희석하여 준비합니다. 박테리아 농도를 결정하기 위해, 1500 Gs에서 20분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 박테리아를 1 × 10¹² CFU/mL 농도로 재현탁합니다.

이제 mL당 1×10¹²에서 1×10⁷ CFU 범위의 여섯 가지 서로 다른 농도로 10 mL의 박테리아 배양액을 준비합니다. 60 mm의 응고된 NGM 플레이트 중앙에 박테리아 배양액 0.2 mL를 피펫으로 분주합니다. 플레이트 표면에 흠집이 생기면 벌레가 배지 내부로 파고들 수 있으므로, 피펫 팁이 플레이트 표면에 닿지 않도록 주의하십시오.

플레이트를 37 °C 인큐베이터에 1시간 동안 둡니다. 그다음 박테리아의 성장을 억제하기 위해 각 플레이트에 100 mg/mL carbonic soin 10 µL와 50 mg/mL can mycin 10 µL를 각각 처리합니다. 서로 다른 항생제 농도로 박테리아를 사멸시킨 플레이트는 향후 사용을 위해 4 °C에서 최대 한 달 동안 보관하십시오.

충분한 양의 플레이트를 준비하고 보관하는 것이 중요하며, 가급적이면 식물 전체에 대해 동일한 배치를 사용하는 것이 좋습니다. 박테리아의 생존력을 확인하기 위해 최소 1~2일 전에 사전 실험을 수행하십시오. SDR 플레이트에서 박테리아를 일부 긁어내어 carbonic, sein 및 antimycin이 포함된 빈 N GM 플레이트에 도말하십시오.

플레이트를 37 °C 인큐베이터에 6~8시간 동안 두고 박테리아 성장이 없는지 확인합니다. 수명 분석 및 자손 생성 프로파일링과 같은 대부분의 SDR 관련 연구에서는 연령이 동기화된 벌레 집단을 준비하는 것이 필수적입니다. 백금 웜 피커를 사용하여 생식 능력이 있는 성체 20~30마리를 여러 개의 일반 NGM 플레이트로 옮깁니다.

OP 50과 함께 준비합니다. 실험에 필요한 알의 수에 따라 더 많은 성충이 필요할 수 있습니다. 산란을 위해 플레이트를 20 °C에서 4시간 동안 둡니다.

플레이트에서 성충을 제거하고 플레이트에 알이 있는지 육안으로 확인합니다. 자손이 L4 후기 또는 성충 1일 차 단계까지 발달할 수 있도록 플레이트를 20 °C에서 계속 배양합니다. 20 °C에서 N2 야생형 벌레의 경우 보통 3일이 소요됩니다.

수명 분석을 위해, 10~12일 된 성체 웜을 SDR 플레이트로 옮겨 식이 제한을 시작합니다. 충분한 통계적 검정력을 확보하기 위해, 각 SDR 조건당 총 60~100마리의 웜을 사용하십시오.

모든 벌레가 죽을 때까지 2~3일마다 각 벌레의 생존력을 측정하십시오. 중요한 점은, 굶주림을 방지하기 위해 이틀마다 벌레를 신선한 SDR 플레이트로 옮겨야 한다는 것입니다. 이 검정 곡선은 OD 600과 OP 50 농도의 상관관계를 나타냅니다.

선형 회귀 분석으로 생성된 방정식은 향후 모든 OP 50 박테리아 농도 계산에 사용될 수 있습니다. 본 연구에서는 SDR 처리의 만성적 영향이 다양한 벌레 균주의 평균 수명에 미치는 효과를 야생형 벌레의 SDR에 대한 정상적인 용량 의존적 반응과 비교하여 분석합니다. SDR의 수명 연장 효과는 DR2 과발현에 의해 부분적으로 억제되는 반면, DAF 16 MU 86 돌연변이는 SDR로 유도된 수명 연장에 영향을 주지 않습니다.

이 영상을 시청한 후에는 Sea Elegance에서 표준 AGA 기반 플레이에 Dian을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.