셀을 별 모양으로 일곱 단계

본 절차의 전체적인 목표는 마우스 간에서 간성상세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 간에 소화 효소를 사용하여 두 차례 관류를 수행함으로써 달성됩니다. 관류 후, 이어서 수행될 인비트로(in vitro) 소화 효율을 높이기 위해 간을 작은 조각으로 자릅니다.

마지막 단계로, 밀도 구배 원심분리를 통해 간성상세포를 다른 간세포 유형으로부터 분리합니다. 최종적으로 간성상세포를 확보하며, 광학 및 면역형광 현미경을 통해 그 순도를 평가할 수 있습니다. 실험 절차 시연은 연구실의 대학원생인 Patrick Meyer가 진행하겠습니다. 마우스 간의 NC two 관류를 준비하기 위해, 먼저 SC one 버퍼와 효소 관류 용액을 37 °C 항온수조에서 가온하십시오.

다음으로, 연동 펌프를 분당 6.5 milliliters의 층류가 흐르도록 설정하고 펌프의 실리콘 튜브를 SC one 용액으로 평형화합니다. 이제 반사 작용의 소실을 통해 마취된 마우스가 깊게 진정되었는지 확인합니다. 그런 다음 마우스를 적절한 지지대 위에 정면을 위로 한 앙와위 자세로 고정합니다.

가위와 포셉을 사용하여 복부 피부를 세로로 절개하고 복막을 노출시킵니다. 복막을 조심스럽게 열고, 문맥을 노출시키기 위해 장을 복강 밖 동물의 왼쪽으로 이동시킵니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 소화 효소를 이용한 간의 제토 관류(zeto perfusion)이며, 이에 대해 시연하겠습니다.

다음으로, 캐뉼라를 삽입할 때는 실체 현미경을 사용하고 관류 동안 간 구조의 변화를 면밀히 관찰하는 것이 중요합니다. 실체 현미경 하에서 주입 세트의 캐뉼라를 문맥에 삽입하십시오. 30 milliliters의 SC one 용액으로 간 관류를 시작하십시오. 흐름이 시작된 직후 하대정맥을 절개하십시오.

간의 세척이 성공적으로 이루어지면 간 조직의 색이 빠진 것을 확인할 수 있으며, 다음으로 30 milliliters의 Pronase E 용액으로 간을 관류합니다. Pronase E 용액 관류 후에는 간엽이 팽창하고 캡슐을 통해 소엽이 뚜렷하게 보일 것이며, 이어 30 milliliters의 collagenase P 용액으로 관류합니다. collagenase P 관류가 완료되면, 횡격막 및 주변 장기에서 간을 조심스럽게 박리하여 적출한 후, 얼음 위에 놓인 70 milliliters의 SC two 용액에 보관합니다.

이 시점에서 간은 형태를 잃고 긴장도가 낮으며 무정형의 모습으로 보입니다. 마우스 간의 소화 과정은 무균 상태의 층류 벤치 내에서 수행되어야 합니다.

날카로운 가위로 간을 약 2×2×2mm³ 크기로 자릅니다. 그다지 SC two 현탁액 70mL와 잘린 간 조각들을 protease E collagenase P 용액 50mL와 혼합합니다. dna, one solution 1mL를 추가하고 37°C에서 교반하며 20분 동안 간을 소화시킵니다.

간 조직의 효소 소화를 거친 후, 밀도 구배 원심분리를 통해 성상세포를 다른 간세포 유형으로부터 분리합니다. 이 절차를 시작하려면, 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 6개의 50 mL 팰컨 튜브에 거르고, E2 버퍼로 세포를 세척한 후 600 G, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하십시오. 원심분리가 끝나면 각 튜브에서 상층액 40 mL를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.

그 다음, 각 튜브에 DNA's one 솔루션 150 µL를 첨가하고 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 50 mL Falcon 튜브 4개에 모으고, 600 ×g, 4 °C 조건에서 10분 동안 원심분리하여 G-B-S-S-P로 세척합니다. 펠렛이 손상되지 않도록 상층액을 최대한 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, 각 튜브에 DNAs one 솔루션 150 µL를 첨가합니다.

튜브당 10 milliliters의 G-B-S-S-B로 세포 펠릿을 부유시킵니다. 세포를 두 개의 50 milliliter falcon tube에 합치고, 튜브당 총 부피가 36 milliliters가 되도록 G-B-S-S-B를 추가합니다. 각 튜브에 14 milliliters의 den solution을 넣고 잘 섞어줍니다.

다음으로, 세포 현탁액 10 milliliters를 12 milliliter 밀도 구배 원심분리 튜브 하나에 옮겨 총 10개의 튜브를 준비합니다. 각 튜브의 세포 현탁액 위에 G-B-S-S-B 1.5 milliliters를 조심스럽게 층분리합니다. 구배 튜브들을 4 °C에서 1500 Gs로 15분 동안 정지 없이 원심분리합니다.

이후 간세포는 튜브 바닥에 펠릿 형태로 가라앉으며, 성상세포는 계면에서 흰색 링 형태로 나타납니다. 5 mL 피펫을 사용하여 성상세포가 포함된 계면을 조심스럽게 회수하여 50 mL 튜브로 옮깁니다. G-B-S-S-B를 첨가하여 세포를 세척하고 600 Gs, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다.

상층액을 흡입하여 제거하고 보충제가 포함된 DMEM 20 milliliters에 세포를 재현탁합니다. 세포 수를 센 후, square centimeter당 2 × 10⁴ cells의 농도로 조직 배양 플라스크에 옮기고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 준비 후 약 2시간이 지나면 간성상세포가 부착되며, 이때 배지를 교체하여 죽은 세포와 세포 부스러기를 씻어냅니다.

세포를 인큐베이터로 옮깁니다. 이 프로토콜을 사용하여 생쥐 간에서 간성상세포를 분리 및 준비한 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 인 비트로(in vitro) 배양 1일 차와 3일 차의 세포는 간성상세포의 특징적인 형태를 보여줍니다. 이들은 성상 세포 모양이며 지질 소포의 저장을 나타냅니다.

핵 내 위치에서 분리된 간성상세포의 순도는 glial fibrillary acidic protein 또는 GFAP의 발현을 통해 확인할 수 있습니다. 이 이미지들은 세포 분리 후 3일 동안 배양한 간성상세포에서 GFAP가 빨간색으로 나타난 대표적인 면역형광 염색 결과를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 순수한 성상세포를 충분한 수율로 얻기 위해 쥐의 간에서 간성상세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

간 관류 시 효율적인 소화를 보장하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 간 담관 세포의 형태와 표현형을 평가하여 분리된 세포의 적절한 개체를 결정하는 것이 필수적입니다.