ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향

다음 실험의 전반적인 목적은 천연 막 환경에서 단백질, transmembrane domains 또는 TMD의 리간드화(ligamentization) 경향을 조사하는 것입니다. 이는 관심 있는 transmembrane domain을 e coli에서 periplasm으로 국소화하기 위한 maltose binding protein 및 전사 리포터인 tox R과 결합된 융합 단백질로 발현함으로써 달성됩니다. transmembrane domain에 의해 유도된 리간드화는 tox R의 이량체화를 유도하고 LXi 전사를 활성화합니다. 두 번째 단계로 세포를 용해하고 ONPG로 처리하며, 이는 beta galacto에 의해 빛을 흡수하는 종인 O nitro pholate 또는 ONP로 가수분해됩니다.

다음으로, 405 nanometers에서 빛의 흡광도를 측정하여 ONP 수준을 정량화합니다. transmembrane domain의 수준을 결정하기 위해, 리간드화 결과는 tox R 리포터 어세이를 기반으로 transmembrane domain의 리간드화 성향을 나타냅니다. SDS page나 형광 분석과 같은 기존의 생물물리학적 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 세제와 같은 막 모방 시스템이 아니라 e coli 내에서의 발현을 통해 천연 인지질 이중층에서 transmembrane domain의 거동을 연구할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 transmembrane Helix Association에 관여하는 주요 구조적 특징의 규명과 같이 막 단백질 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 시작하기 전, NHE I 및 BamH I 제한 효소 부위로 둘러싸인 관심 TDS를 나타내는 상업적 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 필요한 chimeric protein을 발현하는 pET-28a 플라스미드를 준비합니다. 플라스미드가 준비되면 fhk 12 competent cells를 얼음 위에서 천천히 해동합니다. 해동이 완료되면 세포를 1.5 mL 배양 튜브로 옮기고, 각 튜브에 200 ng의 각 플라스미드 DNA를 넣은 후 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 세포를 42 °C에서 90초 동안 열 충격 처리하고, 800 µL의 SOC 배지를 넣은 상태로 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다. 샘플을 37 °C에서 1시간 동안 흔들어 배양한 후, 15 mL 배양 튜브를 사용하여 샘플당 3회 반복으로 chloramphenicol과 aose가 포함된 5 mL의 LB 배지에 형질전환 혼합물 50 µL를 접종합니다. 마지막으로, 샘플을 37 °C에서 20시간 동안 흔들어 배양합니다. 모든 리가네이션을 측정하기 위해 TDS beta galactotase 활성을 결정합니다.

먼저, 플레이트 리더를 28 °C로 예열합니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로 Z 버퍼 스톡을 사용하여 신선한 Z 버퍼 용액을 준비합니다. Z 버퍼 클로로포름의 상층 수성층만 파이펫으로 취하여 튜브에서 리저버로 옮깁니다.

정확한 피펫팅 전송을 위해 그리드가 그려진 종이 위에 96-웰 플레이트를 놓습니다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 µL의 Z buffer chloroform을 넣고, 이어서 각 배양액 5 µL를 4중(quad)으로 분주합니다. 공시료(blank)로 사용할 4개의 웰에서는 배양액을 제외합니다. 플레이트의 OD 595를 측정하여 세포 밀도를 결정합니다.

플레이트의 모든 웰에 50 µL의 Z buffer SDS를 추가합니다. 그런 다음, 세포를 용해시키기 위해 플레이트 리더기에서 10분 동안 플레이트를 흔들어 줍니다. 세포 용해 후, 모든 웰에 ONPG용 ZPA 50 µL를 추가합니다. 플레이트를 다시 플레이트 리더기에 넣고 20분 동안 30초 간격으로 OD 405를 측정합니다.

공시료(blank)로 표준화한 Miller unit 계산을 통해 베타-락타마제(beta lactamase) 활성 수준을 결정합니다. 컨스트럭트 간의 단백질 발현이 동일한지 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행합니다. 먼저, 3회 반복 배양액 50 µL를 혼합한 후 마이크로 원심분리기를 사용하여 샘플을 원심분리합니다.

피펫팅으로 상층액을 제거하고 재현탁합니다. 잔류 펠렛을 2x 샘플 로딩 버퍼에 현탁하고, 표준 8% 젤에 각 샘플을 7.5 µL씩 로딩한 후 125 V에서 1시간 5분 동안 전기영동을 수행합니다. 전이 후, 멤브레인을 anti M-V-P-H-R-P 접합 항체와 함께 배양하여 키메라 단백질을 시각화합니다. 키메라 단백질은 약 70 kDa에서 관찰되며, 때로는 48 kDa 주변에서 일부 분해 산물이 관찰되기도 합니다.

내인성 MVP는 45 kilodaltons에서도 관찰됩니다. 키메라 TMD 컨스트럭트의 적절한 막 삽입 여부를 평가하기 위해, 말토스 결합 단백질이 결핍된 PD 28 세포주를 사용합니다. 말토스를 유일한 탄소원으로 하는 최소 배지에서 배양할 때, 말토스 결합 단백질이 페리플라즘에 정확하게 위치한 막 통합 발현 생성물을 발현하는 세포만이 성장할 수 있습니다. fhk 12 세포와 동일한 방법으로 PD 28 세포를 형질전환하고 2 mL의 LB 배지에 접종하십시오.

배양 후 37°C에서 300 RPM으로 진탕 배양하며 세포를 하룻밤 동안 성장시킵니다. 원심분리를 통해 세포를 침전시키고, 2 mL의 PBS로 재현탁한 후 큰 팁을 사용하여 부드럽게 파이펫팅하여 세척합니다. 침전 후, PBS로 세포를 두 번째로 세척하고, 마지막으로 원심분리를 수행한 다음 1 mL의 PBS에 재현탁합니다.

재현탁한 세포 25 µL를 사용하여 5 mL의 최소 배지에 접종합니다. 세포를 37 °C에서 15시간 동안 진탕 배양합니다. 각 시료 200 µL를 96-웰 플레이트에 옮기고, 플레이트 리더를 사용하여 OD 595 값을 측정합니다.

이 과정을 25시간까지 2시간마다 반복합니다. 다중 막 관통 막 내재성 단백질인 latent membrane protein one의 개별 막 관통 도메인들의 전체적인 리가라이제이션 성향을 tox R 전사 리포터 분석법을 사용하여 분석하였습니다. 막 관통 도메인 5는 양성 대조군인 잘 알려진 이량체화 서열 GPAA와 유사하게 높은 밀러 단위(Miller units)를 보여 강한 리가라이제이션 성향을 나타냅니다.

막 관통 도메인 5의 D150A 유해 돌연변이는 해당 서열의 LMP1 결합 능력을 감소시킵니다. TM1은 유의미하게 결합하지 않으며, 형질전환되지 않은 FHK 12 세포인 공백(blank) 시료의 신호보다 약간 높은 매우 낮은 Miller unit 신호를 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 관심 있는 막 관통 헬릭스가 천연 막 환경에서 고차 복합체를 형성하는 능력이 있는지 판단하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 큰 오차를 방지하고 기포가 유입되지 않도록 96웰 플레이트에 매우 주의해서 피펫팅하는 것이 중요합니다.