입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

본 절차의 전반적인 목표는 비침습적이고 표지자가 필요 없는 생체 내(in vivo) 광학 해상도 광음향 현미경(optical resolution photoacoustic microscopy, PAM)을 이용하여 미세혈관 순환을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 실험 동물을 마취함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 광학 해상도 광음향 현미경의 이미징 헤드를 이동시켜 관심 영역을 설정하는 것이며, 이후 스캐닝 매개변수를 설정하고 이미지 획득을 시작합니다.

최종적으로, 다파장 실험 데이터의 계산을 통해 총 산소 농도와 헤모글로빈의 산소 포화도 분포를 얻습니다. 광학 분해능 광음향 현미경은 레이저 여기와 초음파 검출을 기반으로 합니다. 짧은 펄스 레이저 빔을 생체 조직에 집중시킵니다.

빛 흡수는 일시적인 가열과 뒤이은 초음파 방출을 생성하며, 이를 수신하여 이미지를 형성합니다. 광음향 현미경(PAM)의 고유한 장점은 비접촉식 검출이 가능하며 광 흡수에 대해 매우 정밀한 민감도를 가진다는 점입니다. 이와 대조적으로, 기존의 반사형 또는 광학 현미경 기술은 주로 광 산란이나 형광에 민감합니다. 생체 내(in vivo)에서 표지 없이 광 흡수의 고해상도 이미징을 제공할 수 있는 PAM은 신경학, 안과, 혈관 생물학 및 피부과 분야에서 광범위한 생의학적 응용 분야를 찾았습니다.

광학 분해능 광음향 현미경(optical resolution photoacoustic microscopy, PAMM)은 광학 및 초음파 구성 요소로 이루어져 있습니다. 광 조사원은 고체 펄스 레이저로 펌핑되는 다이 레이저입니다. 출력 레이저 빔은 중성 밀도 필터에 의해 감쇄되며, 단일 모드 광섬유에 결합되어 빛을 전달합니다. 이는 생체 시료 대신 현미경 이미징 헤드를 기계적으로 스캐닝하여 다중 모드 레이저 빔을 단일 모드 광섬유에 효과적으로 결합하기 위함입니다.

먼저 직경 50 µm의 핀홀로 필터링합니다. 핀홀은 그 직경을 기본 모드 빔 직경과 일치시키기 위해 콘덴서 렌즈의 초점에서 약간 떨어진 곳에 위치시킵니다. 회절 한계에 가까운 광학 초점을 생성하기 위해, 싱글 모드 파이버의 출력단을 콜리메이트하여 현미경 대물렌즈의 후방 조리개를 채웁니다.

초음파 검출에는 초음파 트랜스듀서와 연결된 자체 제작 초음파 광학 빔 결합기가 사용됩니다. 이 결합기는 광조사와 초음파 검출이 동축이 되도록 정렬합니다. 결합기 바닥에는 구형 공동이 연마되어 물속에서 개구수 0.5의 음향 렌즈가 형성되며, 이는 50 megahertz 중심 주파수에서 43 micrometers의 음향 초점 직경을 제공합니다.

첫 번째 정렬을 위해, 펄스 에코 초음파를 사용하여 음향 초점 평면의 위치를 결정하는 것이 도움이 됩니다. 최대 펄스 에코 초음파 신호가 관찰될 때까지 이미징 헤드를 수직으로 조정합니다. 검출 민감도를 극대화하기 위해, 광학 초점과 음향 초점을 일치시킵니다. 공초점.

검은색 전기 테이프 조각과 같이 빛을 흡수하는 타겟을 음향 초점 평면에 배치합니다. 그런 다음 광학 초점 위치를 조정하여 광음향 신호를 최대화합니다. PAM 시스템에는 전자 증폭기와 아날로그-디지털 변환기, 기계적 스캐너 및 스캐너 컨트롤러도 포함됩니다.

디지털화된 신호는 이미지 형성을 위해 컴퓨터로 전송됩니다. 소프트웨어는 원시 데이터를 일련의 단면 스캔 이미지로 변환합니다. 현미경 헤드가 시료를 래스터 스캔함에 따라, 기록된 이미지는 개별 단면 이미지, 2D 최대 진폭 투영 이미지 또는 3D 렌더링으로 표시될 수 있습니다.

현미경 이미징 헤드를 수용하기 위해 수조를 사용합니다. 페트리 접시에 이미징 창을 뚫고, 초음파 및 광학적으로 투명한 폴리에틸렌 막으로 밀봉합니다. 대상체에서 생성된 광음향파는 먼저 대상체와 폴리에틸렌 막 사이의 초음파 젤을 통해, 그 다음으로는 페트리 접시 안의 탈이온수를 통해 초음파 검출기로 음향 결합됩니다.

이러한 발명품들과 가용 광학 레이저 및 초음파 트랜스듀서의 응용 기술들이 결합되어 오토포커싱 광음향 현미경(OPAM) 시스템을 구성합니다. 다음 섹션에서는 이 시스템을 사용하여 살아있는 생쥐의 미세혈관을 영상화하겠습니다. 영상 촬영 대상 동물이 누드 마우스가 아닌 경우, 실험 24시간 전에 제모하는 것이 이상적입니다.

이렇게 하여 피부 혈관의 자극 상태가 회복됩니다. 의료용 산소에 3% ISO 플루린을 기화시켜 마우스를 마취시켰습니다. 일반적인 유량은 분당 1에서 1.5 리터 사이입니다.

동물의 체중에 따라 조절합니다. 실험 전 과정 동안 1% ISO fluorine으로 마취 상태를 유지하며, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다. 체온을 37 °C로 유지하기 위해 가열 패드가 설치된 정위 고정대(stereotactic stage)로 마우스를 옮깁니다.

이제 플라스틱 플레이트 위에 귀를 평평하게 폅니다. 그런 다음 귀 위에 초음파 젤을 한 층 도포합니다. 이때 젤 내부에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.

또한 건조 또는 우발적인 레이저 손상을 방지하기 위해 눈에 안연고를 도포합니다. 도포기로 눈을 직접 터치하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 귀를 이미징 창 아래에 두고, 초음파 젤이 막 하단에 닿을 때까지 동물 스테이지를 천천히 올립니다.

귀를 막에 세게 누르면 귀로 가는 혈류에 영향을 줄 수 있으므로 가볍게 접촉해야 합니다. 다음으로, 동물의 생리적 상태를 모니터링하기 위해 몇 가지 주의 사항을 준수하십시오. 펄스 옥시미터를 마우스의 다리나 꼬리에 고정합니다.

이제 음향 렌즈가 탈이온수에 잠길 때까지 이미징 헤드를 내리고 음향 렌즈 아래에 갇힌 기포를 제거하십시오. 레이저를 외부 트리거 모드로 설정하고 시험 스캔을 시작하십시오. 광학 및 음향 이중 초점이 귀의 중앙에 위치할 때까지 이미징 헤드의 Z 위치를 조정하십시오.

이제 스캐닝 파라미터를 설정하고 정식 이미지 획득을 시작합니다. 총 헤모글로빈 농도를 측정하기 위해, 옥시헤모글로빈과 데옥시헤모글로빈의 몰 흡광 계수가 동일한 ISO 등흡수점에 파장을 설정하십시오.

헤모글로빈 산소 포화도를 측정하려면, 옥시헤모글로빈과 데옥시헤모글로빈의 몰 흡광 계수 차이가 뚜렷한 지점으로 두 번째 파장을 설정하십시오. 작업이 끝나면 생쥐의 귀를 세척하고 생쥐를 인큐베이터에 넣으십시오. 주변 온도를 37 °C로 설정하고, 생쥐가 깨어나면 자연스럽게 동물 시설로 복귀시키십시오.

이 최대 진폭 투영 영상은 570nm에서 o-PAM을 사용하여 촬영한 살아있는 누드 마우스 귀의 혈관 해부학적 구조를 보여줍니다. 이 투영 영상은 동일한 귀의 헤모글로빈 산소 포화도를 보여줍니다. 이는 등-흡수점(isosbestic) 파장인 570nm와 탈산소헤모글로빈 흡수 우세 파장인 561nm에서 획득한 영상으로부터 계산되었습니다.

상자 표시된 영역을 자세히 살펴보면 oramm의 해상도를 확인할 수 있습니다. 조밀하게 배치된 모세혈관망이 명확하게 분해되어 보입니다. 이 비디오에서는 시스템 구성, 시스템 정렬, 생체 내 실험 절차 및 기능적 영상화 계획을 포함한 ORPM의 전형적인 실험 프로토콜을 시연하였습니다.

기기 설계 및 작동에서 가장 중요한 요소 중 하나는 광학-음향 공초점 정렬로, 이는 광음향 현미경의 이미징 민감도와 광학 해상도에 결정적인 역할을 합니다. 심부 투과 음향 해상도 광음향 현미경 및 광음향 컴퓨터 단층촬영과의 결합은 생체 내 기능적 및 분자 이미징을 가능하게 하며, 세포, 조직, 장기에 이르기까지 여러 단계의 스케일을 동일한 대조도로 이미징할 수 있습니다. 이러한 이미징 확장성은 미세한 실험실 수준의 발견부터 거시적인 임상 실무에 이르기까지, 다중 스케일 시스템 생물학 및 중개 연구에 혁신을 가져올 잠재력을 가지고 있습니다.