멀티 앵글 조명 및 픽셀 슈퍼 해상도를 채용 Lensfree 온칩 단층 현미경

이 실험 절차의 전반적인 목적은 넓은 이미징 볼륨에 걸쳐 생물학적 시료의 렌즈 없는 온칩(on-chip) 3차원 이미징을 구현하는 것입니다. 이는 먼저 센서 칩 위에 시료를 직접 배치하고 부분 간섭성 조명을 제공함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 서로 다른 위치의 광원을 측방향으로 이동시켜 기록하는 것입니다.

시료의 서브픽셀 이동 홀로그래픽 이미지. 다음 서브픽셀 이동. 토모그래피 이미징을 위해 조명의 배수 지점에서 홀로그래픽 이미지를 기록합니다.

마지막 단계는 데이터 처리 과정으로, 획득한 데이터 세트를 디지털로 재구성하여 최종적으로 시료의 3차원 단층 촬영 영상을 얻습니다. 기존의 일반 광학 현미경과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 소형 구조에서 고처리량 이미징을 제공한다는 것입니다. 이러한 특징 덕분에 본 플랫폼은 랩온어칩(lab-on-a-chip) 플랫폼과의 통합에 특히 유용합니다.

본 보고서에서는 정적 시료의 토모그래피를 위한 벤치탑 구현용 기본 이미징 설정을 설명합니다. 제논 램프가 장착된 모노크로메이터를 조정하여 450에서 650 nanometer의 중심 파장 주변에서 약 1에서 10 nanometer의 스펙트럼 폭을 갖는 출력을 제공하도록 하였습니다. 이러한 부분 간섭성 출력은 이후 멀티모드 광섬유에 결합되어 시스템에 부분 간섭성 빛을 전달합니다.

조사 각도를 변경하기 위해 광섬유를 전동 회전 스테이지에 장착합니다. 광원이 부착된 전동 스테이지는 2차원 선형 XY 스테이지 위에 장착되며, 이는 검출을 위해 특정 각도에서 광원의 평면 이동을 구현하는 데 사용됩니다. 픽셀 크기가 2.2 microns인 5메가픽셀의 CMOS 센서 어레이가 사용됩니다.

검출기는 샘플의 광시야 홀로그래픽 이미지를 기록하는 데 사용됩니다. 센서가 큰 조명 각도에서도 충분한 빛을 받는지 확인하기 위해, 센서 어레이가 광원의 회전축과 동일한 축 평면에 위치하는 것이 매우 중요합니다. 렌즈 없는 광학 토모그래피는 세포 및 미생물과 같은 다양한 객체를 이미징할 수 있지만, 여기서는 메스나 스패튤라를 사용하여 바다민달팽이 샘플의 3차원 현미경 관찰을 수행함으로써 기본 원리를 시연합니다.

실러 기관(sealer organs) 배양액이 담긴 페트리 접시에서 AGA 조각을 소량 덜어냅니다. 각 변의 길이가 수 밀리미터인 정육면체 모양의 조각에는 수백 마리의 선충이 포함되어 있습니다. 이 작은 한천 덩어리를 1 mL의 탈이온수가 들어 있는 폴리프로필렌 바이알에 넣습니다.

30초에서 1분 동안 부드럽게 볼텍싱합니다. 10분에서 15분 후면 벌레가 한천에서 탈출하여 탈이온수로 기어 나올 것입니다. 여기서 벌레들은 너무 작아서 보이지 않음을 유의하십시오. 벌레를 일시적으로 고정하기 위해 1 mL의 5~10 mM Lima를 사용합니다.

용액을 첨가하고 10분 동안 기다립니다. 바이알 바닥에서 5~10 µL의 샘플을 피펫으로 취해 두 개의 커버슬립 사이에 샌드위치처럼 끼웁니다. 일시적으로 고정된 다수의 벌레가 포함된 이 샘플을 검출기에 올려 데이터 수집을 시작할 수 있습니다.

시연을 위해 일반적인 무렌즈 광학 단층 촬영(LOT) 실험의 이미지 획득 단계를 이 섹션에 요약하였으나, 전체 과정은 자체 개발한 LabVIEW 인터페이스를 통해 자동화되었습니다. 수동 단계를 시작하려면, 광원의 수직 위치를 0도로 하여 회전 스테이지의 초기 각도를 -50도로 조정하십시오. XY 스테이지의 초기 위치를 홈 포지션인 0, 0으로 조정하십시오.

회전 스테이지의 각도를 변경하지 않은 상태에서, 포화된 픽셀 없이 이미지가 최대한 밝게 나오도록 검출기의 노출 시간을 조정하여 동적 범위를 최적으로 활용하십시오. 각 이미지당 9장의 이미지를 캡처하십시오. XY 스테이지를 3x3 정사각형 그리드의 새로운 위치로 이동시켜, 각 이미지가 이전 이미지에 비해 약 0.25픽셀씩 이동하도록 하십시오.

객체의 종류와 신호 대 잡음비에 따라 각 각도에서 더 많은 이미지를 획득하면 해상도가 향상될 수 있습니다. 초기 각도에서 9장의 이미지를 수집한 후, XY 스테이지의 위치를 다시 0, 0 위치로 조정하십시오. 그런 다음 회전 스테이지의 각도를 +50도에 도달할 때까지 2도씩 증가시키십시오.

각 새로운 각도에서 증분 시마다 설명된 단계들을 반복하십시오. 각도 증분은 데이터 획득 시간과 이미징 해상도 간의 최적화 정도에 따라 더 세밀하게 또는 더 거칠게 설정할 수 있습니다. 데이터 획득 후에는 51개의 서로 다른 조명 각도에 대해 각각 9개의 서브픽셀 이동 이미지가 포함된 총 459장의 이미지 세트가 획득됩니다.

9장의 이미지로 구성된 각 세트는 픽셀 초해상도(pixel super resolution) 알고리즘을 통해 디지털 처리되어 하나의 고해상도 투영 영상을 얻습니다. 이후 각 각도별 홀로그램 픽셀 초해상도 결과물을 디지털 재구성하여 51장의 투영 영상을 얻습니다. 이러한 데이터 처리 과정이 여기 노트북을 통해 시연됩니다.

그래픽 처리 장치(GPU)를 사용하면 전체 시야에 대한 재구성에 1초 미만이 소요됩니다. 이렇게 얻은 51장의 투영 이미지 세트는 Tom OJA 플러그인을 사용하여 역투영됩니다. Image J의 경우, 투영 이미지를 먼저 Image J로 불러온 후 Tom OJ 플러그인을 실행합니다.

각 투영 이미지에 대한 시야각을 제공하는 룩업 테이블이 OJ로 로드됩니다. 가중 역투영법을 사용하여 시편의 3차원 단층 촬영 이미지를 얻을 수 있습니다. 샘플을 검출기 어레이 상단에 직접 배치함으로써 렌즈리스 광학 단층 촬영의 넓은 시야각이 입증됩니다. 대상의 홀로그래픽 이미지는 24 millimeter square의 시야각 내에서 기록될 수 있으며, 이는 더 넓은 활성 영역을 가진 최신 검출기 어레이를 사용하여 더욱 확대할 수 있습니다.

검출기 어레이의 픽셀 크기가 기록된 홀로그램 이미지의 해상도를 제한하지만, 픽셀 초해상도(pixel super resolution) 기술을 통해 이 문제를 완화할 수 있습니다. 여기에는 픽셀 초해상도가 적용된 홀로그램과 함께, 세 가지 다른 조명 각도에 대해 서브 마이크로미터 단위의 공간 해상도를 제공하는 재구성된 투영 이미지가 나타나 있습니다. 투영 이미지들은 단층 촬영 이미지 재구성 기술을 사용하여 결합함으로써 시료의 TOM 기반 단층 영상을 계산할 수 있습니다. 벌레의 전면부를 통과하는 XY 평면의 세 가지 단면 이미지가 여기에 표시되어 있으며, 약 5 µm의 외부 직경을 가진 대략적인 원통형 구조라는 특성에 따라 인두관은 Z = 8 µm 단면에서만 관찰됩니다.

또한, XZ 평면의 단면 영상은 벌레의 경계와 내부의 인두관을 명확하게 보여주어 인두의 3D 이미징이 성공적으로 이루어졌음을 입증합니다. 이 기술이 발전함에 따라, 연구자들은 수십 밀리미터 길이의 튜브 이미징 볼륨에 대해 3차원 현미경 관찰을 수행할 수 있는 길을 열 수 있을 것입니다. 따라서 렌즈 없는 광학 단층 촬영은 레바논 칩(Lebanon chip) 플랫폼의 고처리량 이미징 응용 분야에서 유용한 도구가 될 수 있습니다.