추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

본 실험 절차의 전반적인 목표는 Q dot 나노 결정(nano crystals)을 이용한 이미징 연구를 위해 수지상 세포를 준비하는 것입니다. 이를 위해 먼저 비장, 대퇴골 및 경골에서 골수 세포를 분리합니다. 그다음, GM CSF 존재 하에서 세포가 수지상 세포로 분화할 수 있도록 골수 세포 배양을 수행합니다.

그 후 8일 뒤에 골수 세포 배양물로부터 수지상 세포를 회수합니다. 절차의 마지막 단계는 형광 Q 나노 결정으로 세포를 염색하는 것입니다. 최종적으로, 밝게 염색된 수지상 세포를 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다.

GFP 태그 수지상 세포를 사용하는 것과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술을 사용하는 주요 장점은, Q dot 나노 결정은 아세톤과 같은 유기 용매로 염색한 후에도 형광을 유지한다는 점입니다. 이 방법은 서로 다른 질병 상황이나 다양한 질병 맥락에서 이러한 세포의 이동 특성과 같이 수지상 세포 생물학자들이 가진 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 염색 과정의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Maria Ali가 진행하겠습니다.

희생 후, 뼈 끝부분이 잘리지 않도록 주의하며 두 마리 마우스의 경골과 대퇴골을 조심스럽게 적출합니다. 그다음 조직지를 사용하여 뼈가 부러지지 않도록 주의하면서 부착된 모든 조직을 제거합니다. 이 과정은 생물안전 작업대 내에서 수행합니다.

35 millimeter 페트리 접시에 70% ethanol을 채운 다음, 뼈를 ethanol에 10분 동안 담급니다. 뼈가 멸균되면 ethanol에서 꺼내어 새로운 페트리 접시에서 5분 동안 자연 건조시킵니다. 이제 대퇴골은 중앙을 자르고, 경골은 가장 얇은 끝부분을 자릅니다.

멸균 주사기를 사용하여 뼈 내부에 RPMI 배지 1 mL를 주입합니다. 세포 현탁액을 15 mL 튜브에 수집하고, 스윙 버킷 로터가 장착된 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 300 ×g로 10분간 원심분리하여 RPMI 배지로 2회 세척합니다. 마지막 세척 후, 적혈구를 제거하기 위해 세포를 2 mL의 CK 용해 버퍼에 재현탁하고 상온에서 5분간 배양합니다.

다음으로, 10% FBS가 포함된 RPMI 13 milliliters를 첨가하고, 이전과 동일한 원심분리 설정으로 이 배지에서 세포를 두 번 더 세척합니다. 세포 수를 측정하여 농도를 2 × 10⁵ cells/milliliter로 조정합니다. 10% FBS가 포함된 RPMI를 사용하여 재조합 murine G-M-C-S-F의 최종 농도가 20 nanograms/milliliter가 되도록 첨가합니다.

그런 다음, 이 현탁액 10 milliliters를 멸균된 미생물학 등급의 10 centimeter Petri dish에 넣고 배양합니다. 세포 현탁액을 이산화탄소 배양기에 넣습니다. 3일 후, 준비된 각 플레이트에 20 nanograms per milliliter의 recombinant murine G-M-C-S-F가 포함된 10% FBS 첨가 RPMI 10 milliliters를 추가로 넣습니다.

3일 후, 각 페트리 접시에서 10 mL의 세포 현탁액을 회수하고, 동일한 조건에서 세포를 원심 분리한 다음, 페트리 접시에서 회수한 것과 동일한 부피의 10% FBS가 포함된 RPMI에 펠렛을 재현탁하고 새로운 recombinant murine G-M-C-S-F를 보충합니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 각 원래의 페트리 접시에 다시 넣고 이산화 탄소 배양기에서 2일 더 세포를 배양합니다. 8일간의 배양 후, 신선한 배지로 페트리 접시를 세척하여 부유 세포 및 느슨하게 부착된 세포를 회수합니다.

그런 다음, 제조사의 지침을 엄격히 따라 Q tracker 6 55 세포 라벨링 키트를 사용하여 10 nM 농도의 Q 나노 결정으로 5 × 10⁶개의 마우스 골수 유래 DC를 라벨링합니다. 먼저, 에펜도르프 튜브에 키트 구성 성분 A와 B를 각각 5 µL씩 혼합하고, 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그 후, 10% FBS가 포함된 RPMI 1 mL를 첨가하고 튜브를 30초 동안 볼텍싱합니다.

다음으로, 0.5 mL의 RPMI 및 10% FBS에 현탁된 5 × 10⁵ 개의 Dcs를 에펜도르프 튜브에 넣고, D 용액 내에서 37 °C로 60분 동안 세포를 배양합니다. 그 후 이전과 동일한 조건에서 RPMI 및 10% FBS로 세포를 2회 세척하고, 펠렛을 RPMI에 다시 현탁합니다.

이 그림은 dcs의 형광 현미경 사진 예시를 보여줍니다. 라벨링 직후, 라벨링된 세포 한 방울을 유리 슬라이드 위에 떨어뜨리고 커버 슬립으로 덮었습니다. 그 후 형광 현미경을 사용하여 샘플을 평가하였습니다.

이 그림에서는 48시간의 인비트로(in vitro) 성숙 후 dcs의 형광 현미경 사진을 확인할 수 있습니다. dcs를 100 ng/mL의 LPS와 20 ng/mL의 TNF alpha와 함께 슬라이드 배양 챔버 내 이산화탄소 배양기에서 48시간 동안 배양하였습니다. 이후 시료를 PBS로 세척하고 아세톤으로 고정한 뒤, DPI로 대조 염색하여 형광 현미경으로 평가하였습니다.

in vitro에서 성숙시킨 라벨링된 dcs를 유세포 분석법으로 분석하였습니다. Q dot으로 염색된 세포는 FL 3 채널에서 강한 신호를 나타내며, Q dot 염색 세포와 비염색 세포를 비교하였습니다. dcs를 성숙 마커인 CD 86 및 CD 40에 대한 특이 항체와 이소타입 대조군으로 추가 염색한 후 유세포 분석법으로 분석하였습니다. 또한, 성숙한 Q 염색 DCS와 대조군의 상층액에서 IL 6 및 산화질소 수치를 측정하였습니다.

여기 절제된 조직 내에 표지된 DCS의 대표적인 이미지가 제시되어 있습니다. 성숙한 dcs를 C 57 black six 마우스에 정맥 주사하였습니다. 3일 후, 마우스를 희생시키고 비장을 수집하였습니다.

OCT에 포매하여 급속 냉동시킨 후, 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 8 µm 두께의 절편을 제작하였다. 그 다음 샘플을 아세톤으로 고정하고 DPI로 대조 염색한 후, 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 이러한 절차를 따랐다.

다양한 성숙 자극에 반응하는 수지상 세포의 이동과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 항원 제시 또는 서로 다른 자극을 이용한 성숙과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.