분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

이 절차의 전반적인 목표는 다운스트림 기능 연구 및 채택 전달 실험을 위해 마우스 골수에서 호중구를 분리하고 표지하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐, 대퇴골 및 경골에서 골수 세포를 수집하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서 적혈구는 각각 0.2% 및 1.6%의 염화나트륨 용액에 순차적으로 현탁하여 삼투압으로 묶입니다.

다음으로, 호중구는 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 분리됩니다. 마지막 단계에서는 호중구를 세포 추적기 염료로 표지합니다. 궁극적으로, 유세포 분석은 다양한 마우스 조직에 동원된 양적으로 전달된 호중구의 수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

혈액이나 복막을 통해 골수에서 마우스 호중구를 분리하는 것의 주요 이점은 정상 상태와 감염 후 모두에서 골수에서 다운스트림 기능 연구 및 채택 전달 실험에 충분한 많은 수의 세포를 얻을 수 있다는 것입니다. 형광 활성화 세포 분류의 면역 자기 선택보다 마우스 호중구를 분리하기 위해 구배 원심분리 기술을 사용하는 이점은 빠르고 경제적이며 호중구 활성화를 유도할 수 있는 항체로 호중구를 표지하지 않는다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 안락사 된 쥐에게 70 % 에탄올을 뿌린 후 내 실험실의 기술자 인 muca swami us가 될 것입니다.

동물 피부의 복부 중간 부위를 절개한 다음 하지를 포함한 동물의 원위부에서 피부 조직을 제거합니다. 다음으로, 가위를 사용하여 동물의 뒷다리에서 근육을 잘라낸 다음 대퇴골 머리가 부러지지 않도록 고관절에서 ACE 요정을 조심스럽게 탈구합니다. 그런 다음 메스에 가위를 사용하여 대퇴골과 경골에 남아 있는 근육을 제거합니다.

무릎 관절에서 다리 뼈를 분리하고 뼈 끝이 부러지지 않도록 주의한 다음 뼈를 얼음처럼 차가운 RPMI 1 6 4 oh가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. FBS와 항생제를 보충하십시오. 접시를 조직 배양 후드로 옮긴 다음 새 페트리 접시에서 70% 에탄올로 각 뼈의 외부를 살균합니다.

약 10-15초 후에 각 뼈 표면의 에탄올을 얼음처럼 차갑고 멸균된 PBS로 세 번 씻어 헹굽니다. 그런 다음 각 뼈의 골단을 잘라내어 새로운 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, 10ml의 RPMI로 채워진 12cc 주사기에 25게이지 바늘을 부착합니다.

FBS 및 EDTA로 보충합니다. 그런 다음 각 대퇴골 경골 쌍의 샤프트 양쪽 끝에서 골수 세포를 100마이크로미터 필터로 퇴색한 50ml 나사 상단 팔콘 튜브로 세척하여 모든 세포를 제거합니다. 바늘 끝으로 뼈의 안쪽 표면을 긁어냅니다.

뼈가 희게 보이면 세포가 충분히 제거된 것입니다. 이제 메스를 사용하여 뼈 골단을 0.5-1mm Q 조각으로 자른 다음 2.5ml einor 빗 팁과 BioPure 피펫 팁의 뒤쪽 끝을 사용하여 100 마이크로 미터 필터를 통해 부수십시오. 수확된 세포를 G 427배, 섭씨 4도의 온도에서 7분 동안 회전시킨 후 20ml의 0.2%염화나트륨 중 적혈구를 약 20초 동안

그런 다음 1.6% 염화나트륨 20밀리리터로 용해를 중지하고 세포를 스핀다운한 다음 FBS 및 EDTA가 함유된 RPMI 1 6 4 oh 보충제에서 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 세고 다시 스핀 다운 한 후, 세척 된 펠릿을 얼음 1 밀리리터 당 6 개의 세포에 100 곱하기 이하로 재현탁시킵니다. 차가운 메마른 PBS는 지금 18-26 섭씨 온도의 3 밀리리터를 분배하고, 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 그의 불투명 한 1 1 1 9를 분배 한 다음 천천히 18-26 섭씨 온도의 3 밀리리터를 오버레이합니다.

그의 불투명 1 0 7 7. 그의 불투명한 1 0 7 7 원심 분리기 위에 골수 세포 현탁액을 조심스럽게 층을 이루고, 밀도 구배를 834 회 G와 25 °C에서 30 분 동안 휴식없이 두 밀도를 혼합하는 것을 피한 다음 그의 불투명 한 1 1 1 9 및 1 0 7 7 층의 계면에서 호중구를 수집합니다. 수집된 호중구를 RPMI 1, 6, 4 oh FBS와 항생제로 2회 세척한 후, Resus는 PBS에서 밀리리터당 6개의 세포에 대해 5배 10으로 세포를 현탁시키고 섭씨 37도로 예열합니다.

세포를 계수한 후 유세포 분석으로 순도와 생존력을 결정하기 위해 각 실험 샘플의 작은 부분 표본을 예약한 다음 어둠 속의 흔들리는 수조에서 섭씨 37도에서 10분 동안 최종 농도 5마이크로몰의 세포 추적기 염료로 나머지 호중구를 라벨링합니다. 마지막으로, 다운스트림 경쟁적 재집단 연구를 위해 차등적으로 표지된 호중구 집단을 혼합하기 전에 염료 교차 오염을 피하기 위해 FBS와 항생제가 함유된 얼음처럼 차가운 RPMI 1 6 4 oh 보충제로 세포를 두 번 세척합니다. 여기에서 감염되지 않은 C 57 black six 마우스에서 골수 분리 밀도 구배로 분리된 호중구의 대표적인 유세포 분석 플롯이 이 패널에 표시됩니다. 조직요법 1 1 1 1 9 및 조직요법 1 0 7 7의 계면에서 수집된 골수 세포에 사용되는 초기 게이팅.

전방 산란 및 측면 산란을 사용하여 밀도 구배로 분리된 호중구가 순도 90% 이상이고 이식 세포 추적기를 채택한 후 최소 4시간 동안 생존 가능한 95% 이상인 것으로 입증되었습니다. DIA 표지 호중구는 다양한 마우스 문제에서 유세포 분석으로 추적할 수 있습니다. 예를 들어, 본 실험에서 나타난 수용자 칸디다균 감염 C 57 블랙 식스 마우스의 혈액, 골수 및 신장에서, 살아있는 CD 45 LY 6 G CD 11 B 세포에 게이팅함으로써, 이러한 대표적인 양양으로 전달된 C-M-T-M-R 표지된 호중구는 이들의 PE 발현에 의해 수용 마우스의 네이티브 C-M-T-M-R 및 PE 음성 호중구와 구별될 수 있다.

일단 숙달되면 마우스 골수 호중구의 분리 및 라벨링을 3시간 내에 완료할 수 있습니다.