의 활동을 Quantifying CIS - 규제 요소

이 절차의 전반적인 목표는 형광 전사 리포터를 사용하여 생쥐 망막 이식편을 전기천공하고 그 발현 수준을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 해부를 통해 신생 생쥐 망막 조직을 분리함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 형광 DNA 리포터 구조체로 망막을 전기천공하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 전기천공법이 수행된 망막을 임플란트로 하여 8일 동안 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 망막 외편물을 회수하고 형광 리포터의 발현 수준을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, x 외편물 전기천공법 후 정량적 데이터 분석을 통해 발달 중인 생쥐 망막에서 서로 다른 프로모터 리포터 제작물의 상대적 발현 수준을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

제 이름은 Joe Corbo이며, 세인트루이스의 Washington University School of Medicine 병리학 및 면역학부 교수입니다. 오늘은 광수용체 특이적 CYS 조절 요소의 활성을 정량화하기 위한 신생 쥐 망막의 ex vivo 전기천공법 기술을 시연하는 비디오 프로토콜을 선보이겠습니다. 이 프로토콜을 시연할 사람은 저희 실험실의 대학원생인 Cindy Montana입니다. 먼저 안구 수집을 준비하기 위해 전기천공 챔버와 모든 도구를 70% ethanol로 멸균하십시오.

에탄올로 장갑과 벤치탑을 모두 소독하고, 실험 과정 전반에 걸쳐 무균 상태를 유지하십시오. 다음으로, 조직 배양 후드 내에서 멸균된 60 mm 페트리 접시 하나에 해부 배지 6 mL를, 멸균된 35 mm 접시 두 개에 배지 각각 3 mL를 피펫으로 분주합니다. 다시 벤치탑으로 돌아와, 70% 에탄올로 신생 생쥐 새끼의 머리와 목 부위를 소독합니다.

가위로 머리를 빠르게 절단한 후, 머리를 멸균된 100 millimeter 디쉬로 옮기고 해부 현미경 하에서 작은 가위로 두피를 잘라내어 눈을 노출시킵니다. 곡선 핀셋을 사용하여 안와에서 눈을 조심스럽게 퍼낸 다음, 해부 배지가 담긴 35 millimeter 디쉬에 눈을 넣습니다. 전기천공법을 적용할 DNA 분취당 3~4개의 눈이 확보될 때까지 계속해서 눈을 수집하며, 수집이 완료될 때까지 눈과 해부 배지를 상온으로 유지합니다.

면도날과 멸균 플라스틱 전이 피펫의 포장지를 70% ethanol로 소독한 후, 면도날을 사용하여 눈 전체를 피펫으로 옮길 수 있을 만큼 충분히 높게 피펫의 끝부분을 잘라냅니다. 넓어진 피펫을 사용하여 해부 현미경의 고배율 하에서 35 millimeter 디쉬의 눈 하나를 60 millimeter 디쉬로 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 눈 표면에서 외안근 및 지방과 같은 조직을 제거합니다.

그 다음 시신경의 기저부를 집어내어 제거합니다. 망막을 분리하기 위해 각막연 부위의 공막에 작은 구멍을 냅니다. 공막과 망막색소상피는 무광 회색인 망막 조직에 비해 광택이 납니다. 두 쌍의 핀셋 중 각각 하나의 끝을 구멍에 삽입하고 공막과 RPE를 조심스럽게 찢어 엽니다.

렌즈가 그대로 유지되도록 주의하십시오. 넓어진 피펫을 사용하여 절개된 망막을 배지가 담긴 두 번째 35 millimeter 디쉬로 옮깁니다. 모든 망막을 수집하여 37 degree Celsius 조직 배양 인큐베이터에 보관하십시오.

전기천공법을 실시하기 전, 조직 배양 후드 내에서 전기천공할 각 DNA 분주액을 준비하며, 멸균된 35mm 디쉬 하나에는 해부 배지를, 두 번째 디쉬에는 배양 배지를 채웁니다. P 200 피펫을 사용하여 전기천공 디쉬의 챔버를 멸균된 1X PBS로 3회 세척합니다. 챔버에 60µL의 DNA 분주액을 채우고, 사용하지 않는 나머지 챔버에는 60µL의 1X PBS를 채웁니다.

전극을 전기천공 컵에 연결하고 전기천공 장치에 적절한 설정을 입력합니다. 미세 핀셋을 사용하여 수정체 부분을 잡고 망막을 전기천공 챔버로 옮깁니다. 각 챔버에 최대 4개의 망막을 배치합니다.

렌즈가 양극에 연결된 금속 바에 기대어 있도록 망막을 배치합니다. 한 챔버에서 다음 챔버로 DNA가 전이되는 것을 방지하기 위해 각 챔버 작업 사이에 포셉을 닦아냅니다. 모든 망막의 정렬이 완료되면 전기천공기의 시작 버튼을 누릅니다.

음극에 연결된 금속 막에 작은 기포가 형성되어야 합니다. 핀셋을 사용하여 전극을 분리하고 전원을 끕니다. 망막을 챔버 벽에서 조심스럽게 떼어냅니다.

챔버에서 망막을 꺼내 해부 배지가 담긴 35 millimeter 접시로 옮깁니다. 멸균된 전송 피펫을 사용하여 망막을 해부 배지에서 배양 배지가 담긴 35 millimeter 접시로 옮깁니다. 멸균된 6-well 배양 플레이트의 웰에 라벨을 붙이고, 각 웰에 3 milliliters의 배양 배지를 채웁니다.

멸균 핀셋을 사용하여 각 웰의 배지 위에 원형 watman nucleo 필터를 띄우되, 필터의 광택이 있는 면이 위를 향하도록 합니다. 해부 현미경의 도움을 받아 멸균 전송 피펫으로 망막 하나를 렌즈 면이 아래로 향하게 하여 필터 위로 옮깁니다. 만약 망막의 렌즈 면이 위로 향한 상태로 놓였다면, 다시 피펫으로 빨아들여 재시도하십시오.

각 웰에 망막을 4개 이하로 넣고 각각 별도의 방울 형태로 유지하십시오. 망막을 웰에 배치한 후, 배양 플레이트를 37 °C 조직 배양 인큐베이터로 옮겨 원하는 시간 동안 배양합니다. 일반적으로 여기서 보이는 바와 같이 8일간 배양하면, 망막 표면의 1/4에서 1/3에 걸쳐 DNA 구조체가 발현되는 성공적인 전기천공 결과가 나타납니다.

형광 수준은 CRE 컨스트럭트를 발현하는 균일하게 전기천공된 영역을 망막 외부 영역과 비교한 후, 대조군 GFP 발현으로 정규화하여 정량화합니다. 특히 간상 광수용체가 효율적으로 형질도입되었음을 확인하였습니다. 여기 두 개의 간상세포 특이적 프로모터가 외핵층에서 GFP와 DS red의 발현을 유도한 전기천공 결과가 제시되어 있습니다.

여기에 파란색으로 표시된 DPI 염색과 두 가지 발현 패턴을 겹쳐 보면, 광수용체 특이적 발현이 분명하게 나타납니다. 중간층이나 신경절 세포층에서는 발현이 관찰되지 않습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 망막 시스트 조절 요소의 활성을 정량화하기 위해 생쥐 망막 절편을 어떻게 분리하고 배양하는지에 대해 잘 이해하시게 될 것입니다.

시청해주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.