에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송

Jane는 생체 내 전기천공법을 이용한 생쥐 내이 발달 연구로 전과하였습니다. Ling Wang, Han Jang, 그리고 John Burgandy, 오리건 보건 과학 대학교 오리건 청각 연구 센터. 안녕하세요. 제 이름은 John Burgandy입니다. 제 연구실은 오리건 보건 과학 대학교의 오리건 청각 연구 센터에 있습니다.

제 이름은 Ang입니다. 저는 Johns 연구실의 포스터 발표자입니다. 또한 저는 Johns 연구실에서 연구 보조원으로 근무하고 있는 Ang입니다.

본 발표는 네 부분으로 구성됩니다. 첫 번째는 복부 정중 절개술입니다. sodium pentobarbital 기반의 마취법, 마취 적절성 확인 방법, 각막 보호, 수술 부위 준비, 소독, 마우스 생존 수술 데이터 시트, 수술실 환경, 피부와 복벽을 통한 복부 정중 절개 및 자궁각 외부 노출 방법을 시연합니다.

두 번째 부분은 자궁 관통 미세주입술입니다. 우리는 배아의 투과 조명, 배아의 방향 재설정, 미세주입, 피펫 제작, 그리고 배아기 11.5일 및 12.5일의 귓바퀴(Otis) 내 미세주입법을 시연합니다. 세 번째 부분은 생체 내 전기천공법입니다.

패들 스타일 전극 배치 방법과 배아 11.5일차 마우스의 O assist 전기천공법을 시연합니다. 네 번째 부분은 대표적인 결과입니다. 후기 배아 및 초기 출생 후 와우에서의 GFP 발현을 보여줍니다.

이는 배아 11.5일에 발현 플라스미드를 이용하여 Otis에-인 비보(in vivo) 전기천공법을 시행한 결과입니다. 1부 복부 정중 절개술. 모묘의 목 뒤 피부, 꼬리, 왼쪽 뒷다리를 잡아 단단히 고정합니다. 70% ethanol로 복부를 닦아낸 후, sodium pentobarbital 기반의 마취제를 복강 내 주사합니다.

마취제가 작용할 수 있도록 마우스를 홈 케이지 안에 4~5분 동안 둡니다. 마취의 적절성을 평가하기 위해 발과 꼬리를 집어 자극을 줍니다. 이 어미 쥐는 꼬리 자극에 반응하여 몸을 떨며, 유해 자극에 반응하지 않는 상태가 되기까지 2분이 더 필요합니다.

각막의 건조를 방지하기 위해 멸균 안과용 연고를 눈에 도포합니다. 털과 비듬의 확산을 최소화하기 위해 화학 흄 후드 내에서 수술 부위를 준비합니다. 미세 날을 사용하여 복벽을 덮고 있는 피부가 드러나도록 털을 깎아냅니다.

털을 완전히 제거하면 수술 후 절개 부위의 치유가 촉진됩니다. 복부 피부의 소독은 70% ethanol, Betadine, 70% ethanol 순으로 번갈아 닦아내어 수행합니다. 항상 머리 쪽에서 꼬리 쪽 방향으로 닦아야 하며, 매번 새로운 수술용 솜 또는 면봉을 사용하십시오.

각 소독 단계마다 호흡의 깊이와 질을 평가하여 모쥐가 반응이 없는지 확인합니다. 70% ethanol로 두 번째 소독을 마친 후, 모쥐의 복면이 아래로 향하게 하여 멸균 드레이프 위에 즉시 놓았으며, 가온 패드 위에 2~3분 동안 올려두어 체온을 높였습니다. 이 시간은 마우스 생존 수술 기록지에 수술 전 데이터를 기록하기에 적절한 때입니다. 마우스 생존 수술 데이터 시트를 보충 정보로 첨부하였습니다.

기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 수술 전, 수술 중 및 수술 후 데이터를 어떻게 모니터링할지 확인할 수 있도록 데이터 시트와 동물 관리 프로토콜을 포함하는 것을 고려하십시오. 수술 대상 개체마다 하나의 기록지를 작성합니다. 설치류의 경우 일반적으로 필수 사항은 아니지만, 무균 환경에서 수술을 진행하는 것을 권장합니다.

작업 표면이 블로워 모터 및 플레넘 하우징과 분리되어 있어 사용자에게 진동이 전달되지 않습니다. 미세주입 과정 중 In utero 유전자 전달을 용이하게 하기 위해 저희가 층류 후드(laminar flow hood)에 적용한 수정 사항의 도식도를 보충 정보로 첨부하였습니다. 주요 변경 사항으로는 저전력 챌린지 및 트랙 조명 컷아웃, 기기 전원 코드를 위한 매립형 콘센트, 그리고 보조 전기 회로를 위한 배선 경로 등이 있습니다. 수술실은 젖산 링거액(lactated ringers) 전기 IV 백, 온수조, XY Z 매니퓰레이터, 스테레오 형광 해부 현미경, 광섬유 광원 및 수술 도구로 구성됩니다.

마이크로 인젝터, 전기 천공기 및 초점 조절을 작동시키기 위해 풋 페달을 사용합니다. 수술용 현미경 기구들은 오토클레이브에서 멸균합니다. 마우스 간 기구 사용 시에는 유리 비드 멸균기를 사용하거나 니들 드라이버를 다시 오토클레이브하여 재멸균해야 합니다.

Balli 가위, 링 포셉 및 혈관 포셉이 필수 도구입니다. 복부 정중선 절개를 실시하고, 혈관 포셉으로 피부를 잡은 뒤 끝이 뭉툭한 가위로 외피를 절제하여 절개 부위를 10 to 14 Millimeters까지 확장합니다. linea alba라고 불리는 흰색의 무혈성 결합 조직 띠와 복부 정중선을 확인한 후, 끝이 뭉툭한 가위로 linea alba를 절개합니다.

장이나 서혜부 지방 패드를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 즉시 복부를 멸균된 예열 젖산 링거 용액으로 세척하십시오. 피부와 복벽의 절개 부위에 출혈이 있는지 확인하십시오.

둔상 포셉으로 직접 압박하여 소량의 출혈이 있는 경우 이를 지혈하고, 링 팁 포셉을 사용하여 좌우 자궁각을 외부로 노출시킵니다. 포셉의 링 끝부분으로 오른쪽 자궁각을 조심스럽게 잡아 자궁을 중앙 절개 부위 쪽으로 끌어당깁니다. 자궁을 걸어 내기 쉽도록 빈 손으로 어미 쥐의 측면을 부드럽게 조작하십시오.

포셉을 사용하여 자궁을 압착하거나 끌어내지 마십시오. 이는 자궁 혈관이나 배아에 손상을 줄 수 있기 때문입니다. 왼쪽 자궁각에 대해 외부 노출 절차를 반복하십시오. 새로 노출된 자궁각을 미리 데워둔 락테이트 링거액(lactated ringer solution)으로 즉시 세척하고, 자궁과 함께 외부로 노출된 내장 지방 패드나 장을 조심스럽게 다시 삽입하십시오.

이는 흔히 발생하는 상황이 아닙니다. 제2부 자궁 미세 주입 단계입니다. 어미 쥐를 장작업거리 대물렌즈 아래에 배치하고, 부드러운 케이블 광섬유 조명을 자궁벽에 밀착시켜 설정합니다.

자유로운 손의 손가락으로 자궁을 부드럽게 누릅니다. 이는 배아의 방향 식별을 용이하게 하기 위함입니다. 광섬유 케이블의 빛은 배아의 방향을 정확하게 평가하는 데 필요한 최소 강도로 설정해야 합니다.

강한 빛은 자궁에 열을 전달하여 합병증을 유발할 수 있습니다. 한 손으로 광섬유 라이트와 자궁을 잡고, 다른 손의 손가락을 사용하여 부드럽게 촉진함으로써 배아의 위치를 재조정합니다. 다음 세 개의 현미경 EC 클립을 통해 자궁에서 관찰되는 일반적인 배아 방향을 보여드립니다.

시청자는 투과 조명 중에 관찰되는 현미경 뷰를 보게 됩니다. 흑백임에도 불구하고 자궁의 투과 조명을 통해 체내(in vivo)에서 배아의 방향을 감지할 수 있습니다. 이 예시에서 배아는 복측 표면이 시청자를 향한 채 머리가 아래로 향한 자세로 있습니다. 자궁을 앞뒤로 움직임으로써 우측 및 좌측 후지와 꼬리, 그리고 좌측 안구 두부를 감지할 수 있습니다.

본 예제에서 배아는 다시 머리가 아래로 향한 자세를 취하고 있으나, 전후축을 기준으로 약 90도 회전되어 있습니다. 자궁을 앞뒤로 부드럽게 움직여 조절함으로써 왼쪽 뒷다리와 왼쪽 앞다리를 정의하는 패들 모양을 확인할 수 있습니다. 후뇌 또한 명확하게 관찰됩니다.

배아는 왼쪽 면이 관찰자를 향하도록 수직으로 세워진 상태입니다. 생성 중인 제4뇌실은 후뇌의 밝은 영역으로 확인할 수 있습니다. 왼쪽 눈의 머리 부분, 왼쪽 앞다리와 왼쪽 뒷다리 또한 뚜렷하게 관찰됩니다.

자궁에 가볍게 압력을 가하면 배아의 방향이 약간 조정되어 주두정맥(primary head vein)의 주간과 각각 흰색 및 검은색 별표로 표시된 전방 및 후방 분지를 검출할 수 있습니다. 이후 확인하겠지만, 오티스(Otis)는 주두정맥의 전방 및 후방 분지 중간에 위치합니다. 오티스 자체는 투과조명을 통해 자궁 너머로 볼 수 없습니다.

두 개의 연속적인 비디오 현미경 클립을 통해 Otis 보조 장치로의 미세주입을 위해 배아의 방향을 재설정하는 방법을 보여드립니다. 목표는 머리 측면에서 otis의 위치를 보간할 수 있게 해주는 배아의 지표들을 식별하는 것입니다. 즉, 우리의 목표는 배아를 등쪽에서 측면 위치로 재배치하여 일차 머리 정맥을 식별하는 것입니다.

배측 위치에서 중뇌, 제4뇌실 및 왼쪽 전지가 확인됩니다. 자궁에 가벼운 압력을 가하면 배아의 방향이 배측에서 측면으로 바뀝니다. 왼쪽 눈, 머리, 중뇌 및 제4뇌실이 명확하게 관찰됩니다.

별표로 표시된 일차 머리 정맥(primary head vein)과 그 후방 분지도 뚜렷하게 보입니다. 일차 머리 정맥의 전방 분지는 명확하게 검출되지 않습니다. 우리의 목표는 다시 한번 자궁 내 미세주입에 적합한 고배율 상태에서 일차 머리 정맥을 식별할 수 있도록 배아의 방향을 잡는 것입니다.

이 측면도에서는 자궁 혈관, 탈락막 띠 및 왼쪽 눈이 관찰됩니다. 자궁에 가벼운 압력을 가하면 배아의 위치가 이동하여, 제4뇌실과 왼쪽 눈을 확인할 수 있습니다. 별표로 표시된 일차 머리 정맥과 그 후분지, 그리고 일차 머리 정맥과 그 분지들은 미식축구의 골대와 같은 형태를 이룹니다.

이청포(otic vesicle)는 자궁을 통해 보이지 않으나, 지지대 중앙에 위치해 있습니다. Lynn은 배아 하나에 대한 주입 시퀀스를 시작했습니다. 그녀는 자궁을 투과 조명하여 미세 주입을 위해 배아의 방향을 재설정하고, fast green이 채워진 미세 주입 피펫을 시야 내로 가져옵니다.

미세 주입 피펫은 X, Y, Z 마이크로 매니퓰레이터(micromanipulator)가 고정하는 피펫 홀더에 부착됩니다. 매니퓰레이터의 마그네틱 스탠드는 테플론 베이스가 있는 강철판에 부착되어 미세 주입 피펫의 대략적인 위치를 손쉽게 조정할 수 있도록 합니다. 매니퓰레이터의 전진 마이크로미터 조절 노브를 사용하여 니들을 적절하게 전진시킵니다.

제작된 피펫은 초기 Otis 단계의 생쥐 배아에 외상성 미세주입을 수행하는 데 필수적입니다. 수평 피펫 풀러를 사용하여 벽이 두꺼운 보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 당깁니다. A에 표시된 결과 피펫은 B의 화살표로 표시된 외경 약 14~16 µm 위치에서 핀셋으로 수동으로 절단합니다. C에 표시된 피펫의 거친 절단면은 톱니 모양이며 깨지기 쉽습니다.

패널 D에서 보는 바와 같이, 피펫 팁을 날카롭게 만들기 위해 피펫을 약 20도 각도로 베벨링합니다. 미세주입 피펫의 인발 및 베벨링을 위한 파라미터는 첨부된 텍스트에 제공되어 있습니다. 다음 두 개의 비디오 현미경 클립에서는 배아기 11.5일 및 12.5일의 생쥐 귀낭(otic vesicle)으로의 미세주입 과정을 보여줍니다. 우리의 목표는 배아기 11.5일 생쥐 귀낭으로의 자궁 내 미세주입을 시연하는 것입니다.

먼저, 정확하게 타겟팅된 주입이 어떻게 나타나는지 명확하게 보여주기 위해 자궁이 없는 상태에서 외이(otics)에 주입합니다. 그 다음, 실제 자궁 내 미세 주입을 시연합니다. 이 첫 번째 주입을 위해, 내장낭(visceral sac)이 돌출될 수 있도록 자궁을 완전히 절개하였으며, 내장 난황낭(visceral yolk sac) 위에 있는 탈락막 밴드(decidual band)를 제거하였습니다.

태반은 자궁에 부착된 상태이며 배아는 살아있습니다. 자궁의 일부를 제거하면 제4뇌실, 주두정맥(primary head vein)과 그 전후분지, 피펫, 그리고 흰색으로 표시된 낭종의 대략적인 위치가 보입니다. 이 주입 시퀀스의 시작 단계에서 내장 난황낭 혈관계의 혈류가 검출됩니다.

피펫을 내장 난황낭을 통해 전진시켜 외이낭에 dai를 주입하며, 내림프관은 배측에, 외이낭의 위치는 수직 구조의 중앙에 둡니다. 외이낭은 일차 두정맥의 전방 및 후방 분지 중간에 위치하며, 배아 11.5일차 마우스 외이낭에 대한 자궁 내 미세 주입을 위해서는 외이낭의 위치를 추정하기 위해 일차 두정맥과 그 분지 중 적어도 하나를 찾아내야 합니다.

이 도식적 예시의 대상에서는 기본 머리 정맥의 전분지와 후분지가 모두 검출되었으며, OUC 영역은 흰색으로 표시되었습니다. 배아의 보다 현실적인 모습은 기본 머리 정맥의 주줄기와 분지 중 하나만 검출되는 경우이며, 제시된 예시에서는 기본 머리 정맥의 후분지만 보이지만 이는 otics의 위치를 해석하기에 충분합니다. PT를 자궁을 통해 진입시킨 후 otics에 염료를 주입합니다.

염료가 양막강에서 빠져나갈 때까지 30초 동안 기다리면, 배측의 내림프관과 전정기관을 확인할 수 있습니다. 마지막으로, 방금 주입을 수행한 배아의 낭을 저배율로 관찰하여 해부학적 관점을 제공하며, 이 시야에서 제4뇌실, 왼쪽 눈 및 자궁 혈관이 보입니다. 본 영상에서는 배아 12일차 생쥐의 이낭(otic cyst) 내로의 미세주입과 후뇌의 초기 제4뇌실 내로의 미세주입 과정을 시연합니다.

투과조명을 통해 이 왼쪽 측면도에서 눈뿐만 아니라 일차 머리 정맥을 검출할 수 있습니다. 피펫을 자궁을 통해 이삭낭(otic vesicle)까지 진입시킨 후, 루멘을 채우기 위해 염료를 주입합니다. 제4뇌실에 주입하기 위해 배아를 90도 회전시켜 후뇌의 등쪽 면이 보이도록 합니다.

주입된 왼쪽 낭종이 이제 왼쪽에 위치합니다. 피펫을 자궁을 통해 진전시켜 fast green과 lor. Conjugated dextran 혼합액을 제4뇌실에 주입합니다.

주입된 염료의 부피가 생체 내(in vivo)에서 중뇌로 진입하지 않는다는 점에 유의하십시오. 제4뇌실 내 덱스트란의 국소화를 확인하기 위해 주입 후 형광을 평가합니다. 그 후 배아를 등쪽에서 가쪽 위치로 다시 방향을 조정합니다.

이 측면도에서 내림프관은 제4뇌실의 바로 복측에 위치합니다. 생체 내 형광 분석을 통해 제4뇌실 내 덱스트란의 국소화를 확인합니다. 출생 시, 에피 형광 현미경을 사용하여 새끼 쥐의 제4뇌실에서 녹색 형광이 나타나는지 스크리닝합니다.

후뇌에 녹색 형광을 띠는 새끼들을 해부 현미경으로 관찰하면, 배아 발생 제3단계인 생체 내 전기천공법(in vivo electroporation)을 통해 내이가 조작되었음을 알 수 있습니다. 발현 플라스미드로 낭을 채운 후, 자궁을 미리 데워둔 젖산 링거액(lactated ringer solution)으로 신선하게 세척합니다. 투과 조명을 이용하면 전극 영역 내에서 ODU 낭의 중심을 잡기가 수월합니다.

광섬유 조명의 금속 헤드를 자궁 표면에서 후퇴시킵니다. 사각파 펄스 열을 시작하기 전에, 다음 비디오 현미경 클립에서 생체 내(in vivo) 전체 전기천공 주기를 보여드립니다. 배아기 11.5일 마우스 이낭(otic cyst)의 전기천공을 위해서는 패들형 전극을 자궁 위에 조심스럽게 배치해야 합니다.

이 예시에서는 왼쪽 귀낭(otic cyst)에 발현 플라스미드를 채웠으며, 자궁은 락테이트 링거액(lactated ringers)으로 막 세척한 상태입니다. 음극은 충전된 귀낭의 외측에 배치하고 양극은 내측에 배치합니다. 전기천공 시퀀스를 시작할 때 귀낭이 패들 전극 영역의 중앙에 오도록 합니다. 자궁을 부드럽게 압착한 후, 풋 페달 스위치를 사용하여 사각파 펄스 트레인(square wave pulse train)을 시작합니다.

이상적으로는 펄스당 60에서 100 mA의 전류가 전달됩니다. 그런 다음 자궁을 놓아주고 즉시 세척합니다. 세척된 자궁은 링 포셉(ring forceps)으로 가볍게 눌러 복강 내로 다시 되돌려 보냅니다.

자궁을 내부로 위치시킨 후, 복강을 약 4 mL의 락테이트 링거액(lactated ringers)으로 세척하고, 복부 수술 직후 평소보다 수분 섭취량이 줄어들 모체(dam)의 수분 상태를 유지하기 위해 약 1 mL의 락테이트 링거액을 복강 내에 남겨둡니다. 그런 다음 니들 드라이버를 사용하여 흡수성 봉합사로 복벽과 피부를 봉합합니다. 저희가 사용하는 니들 드라이버에는 가위가 내장되어 있어 봉합 과정이 더 간편합니다.

복벽과 피부 모두에 연속 봉합법을 사용하는 것을 권장합니다. 절개 부위에 추가적인 지지력을 제공하기 위해 한 땀 건너 하나씩 매듭을 지어 고정합니다. 어미 쥐를 회복 케이지에 넣기 전에 비스테로이드성 항염증제를 피하 투여합니다.

기관 내 동물실험윤리위원회(IACUC)에서 권장하는 예방적 진통제가 무엇인지 수의진료팀과 상의하십시오. 어미 쥐를 멸균 드레이프로 감싸 가열 회복 케이지 바닥에 둡니다. 회복 케이지에는 네스팅 재료, 은신처용 빨간색 튜브, 실험실 사료 및 물병이 들어있어야 합니다.

수술 다음 날 아침, 케이지 상단에 필터 본넷을 씌워 다시 조립합니다. 어미 쥐는 털 상태가 깨끗하고, 보행이 가능하며, 뒷다리로 균형을 잡고 열린 케이지 상단을 살피는 모습을 보입니다. 복부의 봉합선은 깨끗하고 건조하며, 벌어짐, 발적 또는 부종의 증거가 없습니다.

자궁 내 유전자 전달을 위한 동물 관리 프로토콜 개발에 대해 다룬 문서를 첨부하였습니다. 이 문서에는 귀하의 동물 관리 및 사용 위원회와 협의하여 기관별 프로토콜을 설계할 때 유용하게 활용할 수 있는 내용이 포함되어 있습니다. 4부, 대표 결과입니다.

대표 결과 패널 A와 B는 배아기 11.5일에 enhanced green fluorescent protein 발현 플라스미드를 Otis에 주입한 후 전기 천공을 수행한 생후 6일 차 새끼의 대표적인 와우를 보여줍니다. 와우 외측벽을 중간 부위와 정점에서 제거하였습니다. GFP 발현은 와우의 기저부부터 중간 부위까지만 나타나며, 패널 B에 표시된 유모세포 마커 myosin seven A의 분포와 일치합니다. 패널 C는 배아기일의 저배율 공초점 투영 이미지를 보여줍니다.

18.5일령 마우스 와우(organ of Corti)의 면역 염색 결과로, myosin seven A 항체를 사용하여 염색하였습니다. 형질전환된 세포들이 와우 전체에 분포되어 있습니다. 패널 D는 cin.Seven으로 염색된 배아 18.5일령 마우스 와우의 고배율 공초점 투영 이미지를 보여줍니다.

내모세포와 외모세포, interphalangeal 세포, pillar 세포 및 TER 세포에서 GFP 발현이 검출됩니다. 배아기 11.5일에 전정기관으로 전기 천공법을 통한 유전자 전달을 수행합니다. 이는 와우 기관 내의 모든 구성 세포 유형으로 분화하는 전구세포들을 형질전환시킵니다.