바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

이 절차의 전반적인 목표는 뇌 발달의 출생 후 기간 동안 유전자 기능을 조작하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 바이러스를 선택 및 준비하고, 이를 주사기에 넣고 주사 장비를 준비함으로써 수행됩니다. 그 다음 바이러스를 갓 태어난 생쥐 새끼의 뇌에 주입하며, 마지막 단계로 동물을 희생시켜 주입 부위를 이미지화합니다.

최종적으로 면역형광 현미경법을 통해 대조군 세포와 녹아웃 세포의 차별적 표지를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 출생 후 발달 기간이 어떻게 유전적으로 조절되는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주사를 위해, 많은 수의 세포를 조작하기 위해 일반적으로 1mL당 10¹² genome copies의 전체 타이터(full titer)를 가진 상용 아데노 부속 바이러스 용액을 사용할 수 있습니다.

희소하게 처리하거나 표지가 필요한 경우, 1:10 희석부터 시작하십시오. 얼음 위에서 바이러스를 해동한 후, 즉시 희석 전 부피를 멸균된 250 microliter PCR 튜브로 옮기십시오. 희석액은 계속 얼음 위에 보관하십시오.

적절한 시린지를 선택하고 이를 로딩 니들에 연결하여 주입 펌프를 준비합니다. 그다음, 시린지에 아주 작은 기포가 보일 때까지 바이러스 용액을 천천히 흡입하며, 이 단계에서 불활성 로딩 다이를 사용하면 작업이 더 수월해질 수 있습니다. 이제 리테이너를 사용하여 시린지를 펌프에 고정합니다.

그 다음 주사기와 니들 홀더 사이에 연결 튜브를 조심스럽게 연결합니다. 이때 주사 바늘이 니들 홀더 내부의 연결 튜브와 직접 접촉하고 있는지 확인하십시오. 이제 솔루션이 바늘 끝에 작은 한 방울 보일 때까지 연결 튜브를 통해 천천히 이동시킵니다.

펌프의 브래킷을 사용하여 푸셔 블록 옆의 플런저를 조심스럽게 고정합니다. 주입 속도를 8 µL/min으로 설정하고, 주입 부피를 1~2 µL 사이로 설정합니다. 그런 다음 사용하는 시린지의 직경과 일치하도록 펌프의 시린지 직경 설정을 조정합니다.

마지막으로, 회복 단계 동안 새끼 쥐를 보호하기 위해 핫플레이트를 38 °C로 설정하고 페이퍼 타월로 덮어줍니다. IACUC 승인 프로토콜에 따라, 새끼 쥐(P0 또는 P1)를 저온 마취시켜 주사 준비를 합니다. 페이퍼 타월 몇 장을 물로 적신 후 얼음 위에 올려둡니다.

그런 다음 네다섯 마리의 새끼 쥐를 키친타월 위에 서로 충분히 떨어뜨려 놓습니다. 새끼 쥐 위로 키친타월을 조심스럽게 덮고, 키친타월 위에 소량의 잘게 부순 얼음을 올린 뒤 약 5분 동안 새끼 쥐를 안정한 상태로 둡니다. 새끼 쥐는 최대 15분까지 얼음 위에 안전하게 유지할 수 있으며, 이후에도 원활하게 회복될 수 있습니다.

이제 주사 부위에 가장 쉽게 접근할 수 있도록 마취된 새끼 쥐를 고정 블록 위에 배치합니다. 예를 들어, 동물을 배가 아래로 향하게 평평하게 눕히면 피질에 가장 쉽게 접근할 수 있습니다. 반창고를 사용하여 새끼 쥐를 고정할 수 있으며, 새끼 쥐의 머리를 수동으로 안정시키고 피부를 팽팽하게 당겨 움직이지 않도록 합니다.

그 다음 람다 봉합선(lambda suture)과 같은 두개골의 해부학적 지표를 확인하고, 다른 한 손으로 재현 가능한 주입 지점을 선택하여 바늘을 두개골에 천천히 삽입합니다. 바늘이 두개골을 쉽게 통과하지 않을 경우 세게 밀지 마십시오. 대신 바늘의 위치를 조정하여 다시 조심스럽게 시도하십시오.

피질의 경우 주입 깊이는 개별 동물과 계통마다 약간씩 다르나, 보통 0.5~1 mm 깊이가 적절합니다. 이제 손의 움직임을 최소화하기 위해 동료가 펌프를 작동시키도록 하여 바이러스 용액을 주입하십시오. 가급적이면 풋 페달을 사용하여 주입 후 펌프를 작동시키는 것이 좋습니다.

바늘을 몇 초 동안 그대로 유지한 다음, 강아지의 머리를 부드럽게 고정한 상태에서 바늘을 천천히 뽑아냅니다. 이제 덮개가 덮인 가열판 위에서 강아지가 5~10분 동안 회복하도록 둡니다.

이 시간 동안 다른 새끼들에게 계속해서 주사를 놓으십시오. 새끼들이 모두 분홍색을 되찾고 움직이기 시작하면, 원래의 베딩 일부로 새끼들을 부드럽게 문질러 줍니다. 그 후에만 새끼들을 어미에게 돌려보낼 수 있습니다.

그렇지 않으면 이들은 낯선 새끼로 취급될 수 있으며, 새끼들이 어미에게 돌아간 후 어미가 이들을 죽일 가능성이 매우 높습니다. 주사기를 아세톤 또는 70% ethanol로 완전히 채워 주입 장치를 세척하십시오. sano, acurate, 접착제와 같이 아세톤에 민감한 구성 요소가 사용된 경우, 매번 새 용액을 사용하여 주입 장치에 용액을 여러 번 흘려보내십시오.

이렇게 하면 남아 있는 바이러스 용액과 침전물이 제거되며 용매가 증발하게 됩니다. 설정을 세척한 후, 다음 실험자가 사용할 수 있도록 표백제로 작업 구역을 소독하십시오. 숙련된 기술을 통해 주입 부위에 강력한 뉴런 감염을 유도할 수 있습니다.

피질 및 상구와 같은 특정 부위에 주입하면 일반적으로 인접 부위로의 확산이 최소화된 국소 감염이 유도됩니다. 고역가 바이러스 용액을 사용하면 해마와 같은 인접 영역의 감염 가능성이 높아지는 반면, 저역가 바이러스 용액을 주입하면 일반적으로 정중선에서의 소뇌 주입과 같이 주입 부위 근처에 희소한 감염이 나타납니다. 감염된 세포의 수는 주입된 바이러스 용액의 역가와 상관관계가 있어야 합니다.

예를 들어, 서로 다른 형광 단백질을 발현하는 두 가지 R AAV eight 바이러스의 고역가 용액 혼합물을 소뇌에 주입하면, 서로 다르게 표지된 많은 Purkinje 세포를 감염시킬 수 있습니다. 반대로, 저역가 바이러스 용액을 주입하면 단일 세포 시각화를 돕기 위해 드문드문 감염시키는 결과를 얻을 수 있습니다. 형광 표지된 뉴런은 신선하게 절단된 살아있는 조직에서 직접 관찰하거나, 면역 염색을 수행할 수 있습니다.

이는 광시야 또는 공초점 형광 현미경을 이용한 이후의 이미지 획득을 위해 내인성 형광 신호를 강화합니다. 마지막으로, RAAV eight은 피질의 다양한 뉴런 유형을 감염시킬 수 있으며 미세 돌기를 강력하게 표지합니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 약 30분 만에 완료할 수 있습니다.