강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에

신경과학에서 발달 과정을 연구할 때 직면하는 과제 중 하나는 생체 내(in vivo)의 단일 세포 수준에서 수지상 돌기 및 축삭의 형태를 포착하는 것입니다. 후각 시스템에서 후각 신경세포는 코의 후각 상피에서 뇌의 후각구까지 축삭을 뻗습니다. 여러 후각 신경세포가 후각구를 향해 투사함에 따라, 이들은 다발 형태로 묶이게 됩니다.

이는 개별 축삭의 경로와 그 말단 형태를 연구하는 것을 어렵게 만듭니다. 본 연구진은 GFP 구축물을 포함하는 렌티바이러스를 미세 주입하여 살아있는 상태에서 단일 후각 sensory 뉴런을 시각화하는 방법을 개발하였습니다.

렌티바이러스(lentivirus)를 이용한 성공적인 형질전환은 말단 수지상 돌기를 포함한 후각 감각 축삭의 전체 길이를 시각화합니다. 이 방법은 단일 후각 감각 뉴런을 시각화할 뿐만 아니라, 특정 표적 유전자의 발현을 조절하여 생체 내(in vivo) 환경에서 해당 유전자의 기능을 연구할 수 있게 합니다. 본 렌티바이러스 프로토콜은 생물안전 2등급(biosafety level two) 작업이며, 반드시 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 수행되어야 합니다.

멸균 환경을 유지하기 위해, 후드 내로 반입하는 모든 물품에 70%ethanol을 분사하십시오. 주입 전, 37 °C 워터베드를 준비하고 최소 20분 동안 예열하십시오. 물을 절반 정도 채운 플라스틱 보관 백을 밀봉하여 빈 가열 블록 인큐베이터 위에 올려두십시오.

이를 통해 마우스가 주사 후 회복할 수 있게 합니다. 바이러스에 노출된 모든 물질을 오염 제거하기 위해 생물학적 위험 폐기물 용기에 10% bleach를 채웁니다. 이 절차를 위해 70% ethanol을 담은 작은 개방형 접시와 멸균 증류수가 담긴 두 번째 접시를 준비합니다.

층류 정화대(laminar flow hood) 내에서 33 gauge 바늘이 장착된 5 µL 용량의 Hamilton 시린지를 사용하겠습니다. 이 특정 모델은 플런저 챔버 상단에 위치한 장력 다이얼을 돌려 플런저 저항을 조절할 수 있습니다. 이 기능은 바늘과 시린지 챔버를 멸균하는 과정에서 미세 주입 부피를 정밀하게 제어할 수 있게 해줍니다.

디쉬에서 에탄올을 여러 번 반복적으로 흡입하고 배출합니다. 멸균수를 여러 번 흡입하고 배출하여 시린지 카트리지를 헹굽니다. 시린지를 플로우 후드 내 안전한 곳에 둡니다.

알코올 솜을 주사 스테이션 근처에 배치하십시오. 마우스의 위치 잡기를 용이하게 할 수 있도록 높이가 있는 주사대를 준비합니다. 10 cm 배양 접시를 뒤집어 그 위에 Kim wipes를 덮어 사용할 수 있습니다.

마우스 새끼는 이유 시기 전까지 저체온법으로 마취할 수 있습니다. 고무장갑의 손가락 부분을 잘라낸 후 그 안에 마우스 새끼를 넣습니다. 그런 다음 5분 동안 얼음 위에 둡니다.

장갑은 얼음과 피부가 직접 접촉하여 발생할 수 있는 동상을 방지합니다. 강아지의 뒷발과 앞발 네 곳을 집어 동물에 반응이 없는지 확인하여 마취가 충분히 되었는지 테스트합니다. 이제 렌티바이러스(lentivirus)를 미세 주입할 준비가 되었습니다. 신생 강아지를 통해 시연하겠습니다.

더 고령의 마우스를 사용하는 경우, 두개골 표면을 관통하기 위해 33 gauge 바늘을 더 굵은 gauge 바늘로 교체해야 합니다. 알코올 솜으로 마우스의 코 표면을 닦아 멸균합니다. 냉동 보관 중인 렌티바이러스 스톡을 꺼내 얼음 위에서 해동합니다.

우리는 기성 방법을 사용하여 연구실에서 직접 렌티바이러스를 생산했습니다. 이 방법을 개발하면서, 양호한 형질전환 효율을 얻기 위해서는 최소 10⁹ infectious units/mL의 바이러스 타이터가 필요하다는 것을 확인했습니다. 멸균된 Hamilton 시린지로 렌티바이러스 스톡 용액 2 µL를 흡입하십시오.

마우스 새끼를 주입 스테이지 위에 놓습니다. 귀 쪽의 머리 위 피부를 잡고 부드럽게 뒤로 당깁니다. 당사의 플로우 후드에는 해부 현미경이 설치되어 있습니다.

미세 주입을 정확하게 수행하기 위해, 전뇌의 등쪽 두개골 표면에서 후각구의 윤곽을 찾습니다. 미세 주입 대상 부위는 후각구를 밀접하게 둘러싸고 있어야 하지만, 후각구 자체는 포함되어서는 안 됩니다. 각 새끼 쥐의 후각 상피에 네 군데의 주입을 실시합니다.

파란색 점으로 표시된 이 위치들은 바늘을 내측 방향의 각도로 삽입해야 합니다. 초록색 점으로 표시된 추가 2회 주사는 후각구보다 더 내측 및 전측에 엇갈리게 배치됩니다. 이 주사들은 각도를 조절하여 진행할 수 있습니다.

바늘 각도 제안은 후각 상피의 복측 위치를 고려하여 이루어졌으며, 후각 상피는 대부분 후각 구 아래에 위치합니다. 따라서 수직 접근은 제한적입니다. 피부 표면에서 약 3mm 아래의 비강 상단을 통해 바늘을 삽입하십시오.

후각 상피에 도달하기 위해서입니다. 숙련된 연구자는 비강 내강 공간에 도달했을 때 저항이 감소하는 것을 느껴야 합니다. 이 영역은 피해야 합니다.

위치당 0.5 µL의 바이러스 스톡 용액을 미세 주입합니다. 다시 각 측면(좌측 및 우측)에서 두 곳의 지점을 선택하여, 총 네 곳에 0.5 µL씩 주입합니다. 이는 한 번의 주입 세션당 마우스 한 마리당 총 2 µL의 바이러스가 필요함을 의미합니다.

다시 한번, 후각구에 주입할 때 주입 부위나 콧구멍 개구부에서 흘러나올 수 있는 잔류 바이러스 용액이나 혈액을 닦아내지 않도록 주의하십시오. 에탄올 솜을 사용하여 닦아낸 후, 솜은 희석된 액체 표백제 용기에 폐기하고, 주입이 완료된 마우스는 즉시 회복을 위해 워터베드 인큐베이터에 놓으십시오. 준비 단계에서 수행했던 멸균 절차를 반복하여 바늘 주사기를 오염 제거하십시오. 주입된 마우스는 워터베드 인큐베이터에서 30분간 회복한 후 원래의 케이지로 돌려보낼 수 있습니다.

이 전체 미세주입 과정은 4시간 후에 다시 반복할 수 있습니다. 감염시킬 후각 감각 신경세포의 수를 늘리고자 하는 경우, 감염된 후각 감각 신경세포는 빠르면 3일 만에 세포 전체 길이에 걸쳐 시각화될 수 있습니다. 동물들은 원하는 시점에서 관찰을 위해 희생시키고 관류합니다.

형질전환된 단일 세포 후각 감각 뉴런의 궤적과 축삭 말단을 시각화하기 위해, 표준 방법을 사용하여 후각구를 60 micron 두께로 관상면 절단 및 섹셔닝합니다. 이렇게 하면 부유 면역 조직 화학 염색을 준비하는 과정에서 후각구 표면에 경계가 형성된 사구체 구조 내에 시냅스를 형성하는 후각 감각 뉴런의 축삭 다발과 축삭 말단을 포함하여 후각구의 모든 세포층이 섹션에 포함되게 됩니다. 후각구의 연속 절편을 제작하고, 이를 5 milliliters의 인산염 완충 식염수가 담긴 10 centimeter 배양 접시에 한데 모읍니다.

부유하는 절편들을 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 절편들이 튜브 바닥에 가라앉으면, phosphate buffered saline을 진공 흡입하여 제거합니다. 이때 절편까지 함께 흡입되지 않도록 주의하십시오.

각 절편에 10 milliliters의 신선한 완충액을 채워 잔류 고정제나 포매제를 씻어냅니다. 이 재현탁액을 즉시 15 milliliter 원추형 튜브에 피펫으로 옮기되, 떠다니는 모든 절편이 포함되도록 주의하십시오. 세척액을 진공 흡입하여 제거한 후, phosphate buffer saline에 0.3%Triton X 100을 섞은 용액으로 절편을 투과화시키며 로커 플랫폼에서 10분 동안 반응시킵니다. 실온에서 동일한 원추형 튜브를 사용하여 표준 면역 염색 프로토콜을 진행할 수 있으며, 이 크기의 용기에 맞게 진공 흡입 및 로킹 단계를 필요에 따라 반복하고, 염색 및 세척 단계에서는 10 milliliter의 부피를 유지하십시오.

다음은 양성으로 형질전환된 후각 신경세포와 일반 후각 신경세포 집단을 공동 염색하는 데 사용하는 항체 목록입니다. 60 µm 두께의 구구(bulb) 절편에 항체가 충분히 침투하도록 하려면 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하는 것을 권장합니다. 세척 단계 또한 각각 20분 이상 수행해야 합니다.

붓을 사용하여 각 절편을 슬라이드 글라스 위에 조심스럽게 펴고, 염색액이 첨가된 flora Mount G로 각 슬라이드를 마운팅합니다. 마운팅 매질 내의 모든 기포를 제거하도록 노력하십시오. 이후의 스크리닝 단계를 간소화하기 위해 절편들을 행 단위로 배열하여 마운팅하십시오.

면역 염색된 구형(bulb) 절편의 이 층들을 스캔하여 GFP 양성 축삭 섬유와 종말을 찾으십시오. 형광 현미경을 사용하여 감염이 확인된 신경 종말을 공초점 현미경으로 촬영할 수 있습니다. DPI 및 후각 마커 단백질(olfactory marker protein) 채널을 사용하여 관심 영역의 초점 평면을 보정하는 것이 도움이 됩니다.

이 결과는 사구체 내의 단일 후각 센서 뉴런 축삭 섬유와 축삭 말단을 보여주며, 여기서 후각 마커 단백질은 적색으로, vlu two로 감염된 후각 센서 뉴런 세포체는 회색으로 표시되었습니다. 만약 해부 및 면역 염색 단계에 이 조직이 포함되었다면, 이들의 수지상 돌기 결절 또한 후각 상피 내에서 시각화될 수 있습니다. 이 공초점 투영 영상은 단일 후각 감각 뉴런의 축삭 연장 경로와 말단 수지상 분지의 매우 상세한 형태학적 구조를 제공합니다. 축삭 섬유가 사구체 표적으로 다시 굽어 들어가는 모습과 사구체 신경망 내에서의 분지 패턴에 대한 세부 사항을 확인할 수 있습니다.

렌티바이러스 미세주입법을 이용하면 단일 세포 축삭 및 후각 신경세포의 형태를 시각화할 수 있으며, 유전자 발현을 조절하는 연구가 가능합니다. 렌티바이러스 형질도입은 구성물의 안정적인 게놈 통합을 유도합니다. 렌티바이러스는 시냅스를 통해 인접 세포로 감염되지 않습니다. 시각화는 최소 3일 만에 가능하며, 최소 3개월 동안 유지됨이 확인되었고 아마도 더 오랜 기간 지속될 것입니다.

후각 감각 뉴런은 렌티바이러스 용액을 비강 내로 주입하는 방식으로는 쉽게 감염되지 않습니다. 따라서 본 절차에서는 표면을 통한 미세주입이 필요합니다. 이것으로 렌티바이러스 미세주입 절차를 마치겠습니다.

이 모든 정보가 귀하의 단일 세포 형태학 연구 성과를 달성하는 데 유용했기를 바랍니다. 좋은 결과 있으시길 바랍니다.