확장 병리학: 임상 조직 샘플의 고해상도 광학 이미징 방법

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

0 조회수 • 4:14 분 • April 30th, 2023

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확장 병리학(ExPath)은 생물학적 표본을 위한 샘플 준비 기술로, 기존의 광학 현미경으로 폴리머 시스템을 사용하여 구조를 확장하여 나노 규모 구조를 이미지화할 수 있습니다.

먼저, 처리된 면역염색 조직 표본 슬라이드를 가져와 단백질 및 고분자 반응기를 모두 포함하는 앵커링 용액으로 덮습니다. 고정 시약의 단백질 반응성 그룹은 세포 내 생체 분자의 아민에 결합합니다.

다음으로, 표본 위에 적절한 겔화 용액을 추가하고 조직 내부로 확산되도록 배양합니다. 고정 시약의 폴리머 반응기는 겔화 용액 내의 유리 단량체에 결합하여 중합될 때 생체 분자가 폴리머에 고정되도록 합니다.

샘플 중합이 완료되면 슬라이드를 프로테이나제 용액으로 덮습니다. 단백질분해효소는 세포골격 단백질을 소화하여 구조적 저항을 제거하여 세포가 파열되지 않고 확장되도록 합니다. 효소 분해 시 겔화된 샘플은 슬라이드에서 분리되어 현탁액으로 이동합니다.

이제 표본을 현미경 호환 용기에 담긴 적절한 세척 완충액으로 옮깁니다. 그런 다음 완충액을 물로 교체하고 배양합니다. 폴리머는 질량에 비해 엄청난 양의 물을 흡수하고 팽창합니다.

폴리머가 팽창함에 따라 폴리머 네트워크에 고정된 생체 분자는 공간 방향을 유지하면서 분리됩니다. 이를 통해 기존의 광학 현미경으로 쉽게 시각화할 수 있습니다.

원고 지침에 따라 앵커링 용액을 준비합니다. 슬라이드를 100mm 페트리 접시에 놓습니다. 고정 용액을 조직 위에 피펫팅하고 실온에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 원고 지시에 따라 겔화 용액을 준비합니다.

조직 절편에서 여분의 고정 용액을 제거하고 슬라이드를 페트리 접시에 다시 넣습니다. 신선한 차가운 겔화 용액을 샘플에 첨가하고 혼합물을 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 샘플 주위의 슬라이드에 챔버를 구성하려면 다이아몬드 나이프로 커버 유리 조각을 얇게 절단하여 스페이서를 만듭니다. 티슈 양쪽의 스페이서를 물로 고정하고 슬라이드 위에 뚜껑 유리 뚜껑을 조심스럽게 놓아 티슈 위에 기포가 끼지 않도록 합니다.

그런 다음 샘플을 섭씨 37도에서 가습 환경에서 2시간 동안 배양합니다. 면도날을 커버슬립 아래로 부드럽게 밀어 넣고 젤 표면에서 천천히 들어 올려 겔화 챔버의 뚜껑을 제거합니다. 부피를 최소화하기 위해 조직 주위의 빈 젤을 다듬고, 방향을 추적하기 위해 젤을 비대칭으로 절단해야 합니다.

분해 완충액에 Proteinase K 1:200으로 희석하고 겔이 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 용액을 준비하십시오. 그런 다음 밀봉된 용기에 용액과 함께 샘플을 섭씨 60도에서 3시간 동안 배양합니다. 분해 중에 샘플이 분리되지 않으면 면도날을 사용하여 부드럽게 제거합니다.

부드러운 붓을 사용하여 원하는 이미징 시스템과 호환되고 완전히 팽창된 젤을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 용기에 담긴 1X PBS로 표본을 옮깁니다. 샘플을 PBS에서 10분 동안 세척하고 원하는 경우 300밀리몰 DAPI로 재염색합니다. 세척당 10분 동안 과량의 이중 증류수로 샘플을 3-5회 세척하여 샘플을 확장합니다. 그런 다음 형광 이미징을 수행합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026