애기장대 식물의 이진 박테리아 인공 염색체 벡터 기반 유전자 변환: 단일 사본 삽입으로 형질전환 식물을 생성하는 기술

미성숙한 꽃 머리를 가진 애기장대 식물부터 시작하십시오. 대장균과 아그로박테리움 시스템 모두에서 복제되는 벡터인 이원 박테리아 인공 염색체 또는 BIBAC로 복제된 T-DNA를 운반하는 아그로박테리움 세포 현탁액에 꽃 머리를 담그십시오. 이 T-DNA 이진 벡터는 종자 특이적 프로모터를 따라 제초제 내성 유전자 및 형광 선택 가능한 마커와 같은 대형 이식유전자를 전달할 수 있습니다.

꽃 머리가 아직 잠겨 있는 동안 식물을 부드럽게 저어주어 아그로박테리움과의 접촉을 강화합니다. 식물을 감염시키는 고유한 능력으로 Agrobacterium은 이식 유전자를 꽃 세포로 전달합니다. 이식유전자가 세포에 들어가면서 핵으로 이동하여 식물 게놈과 융합합니다.

이제 식물을 접착 필름으로 싸서 어둠 속에서 배양하여 습도를 유지하여 변형을 개선합니다. 필름을 제거하고 씨앗을 생산할 때까지 생리학적 조건에서 식물을 키웁니다.

다음으로, 종자를 수확하고 형광 현미경으로 관찰하여 형질전환체를 선택합니다. 이제 변형된 씨앗을 발아할 때까지 적절한 조건에서 재배하십시오. 식물에 제초제를 뿌리고 배양하십시오.

다중 이식유전자 삽입이 있는 식물은 유전자 침묵을 경험하고 시드는 반면, 단일 카피 삽입이 있는 식물은 활성 제초제 대사 효소를 발현하고 치료 후에도 생존합니다. 살아남은 형질전환체에서 게놈 DNA를 추출하고 PCR을 수행하여 단일 사본 삽입의 효율성을 계산합니다.

기장대 식물의 변형을 준비하려면 애기장대 식물이 개화할 때까지 온실이나 기후 조절이 가능한 성장실에서 애기장대 식물을 재배하십시오. 첫 번째 볼트를 고정하여 더 많은 보조 볼트가 나올 수 있도록 합니다. 식물은 깎은 후 4-6일 후에 담글 준비가 되는데, 이때 식물에는 미성숙한 꽃 머리가 많고 수정된 고굴이 많지 않습니다.

꽃 담그기를 수행하려면 꽃차례를 Agrobacterium 현탁액에 5-10초 동안 담그십시오. 부드럽게 교반하십시오. 식물의 지상 부분을 접착 필름으로 싸서 습도를 높게 유지하고 화분을 상자로 덮어 식물을 어둠 속에 보관합니다.

온실이나 성장실에서 이틀 동안 식물을 배양합니다. 이틀 후 상자와 접착 필름을 제거하고 온실이나 성장실에서 식물을 성숙할 때까지 키웁니다. 변형 효율을 높이기 위해 동일한 식물을 첫 번째 침지 후 7일 후에 다시 담글 수 있습니다.

다음으로, 변형된 식물이 성숙하고 건조되면 씨앗을 수확합니다. 동일한 구조로 변형된 식물의 씨앗을 단일 세트로 풀링하고 분석합니다. 식물이 BIBAC-RFP-Gateway 플라스미드 유도체로 형질전환되는 경우 형광 현미경을 사용하여 종자를 분석하여 형질전환 식물을 식별합니다.

종피에서 DsRed 발현을 검출하려면 560나노미터의 여기와 600-650나노미터의 방출에서 종자를 이미지화합니다. 집게를 사용하여 형광 종자와 형광 종자를 분리합니다.

BIBAC-BAR-Gateway 플라스미드 유도체로 형질전환된 형질전환 식물을 스크리닝하려면 토양으로 채워진 트레이에 씨앗을 뿌립니다. 0.5X MS 배지의 0.1% 한천에 종자를 현탁시키고 1밀리리터 피펫을 사용하여 종자를 퍼뜨려 트레이 위에 씨앗이 고르게 퍼지도록 합니다.

섭씨 4도에서 최소 이틀 동안 씨앗을 배양하여 동시에 발아하도록 자극합니다. 이것은 씨앗을 뿌리기 전이나 후에 할 수 있습니다. 씨앗을 뿌린 후 2주와 3주 후에 묘목에 0.5% 글루포시네이트-암모늄 용액을 뿌립니다. 1제곱미터당 500밀리리터의 글루포시네이트-암모늄 용액을 사용하십시오. 살아남은 묘목을 화분으로 옮깁니다. 관심 있는 구조의 존재에 대해 PCR을 통해 글루포시네이트-암모늄 내성 식물을 분석합니다.