사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

다음 실험의 전반적인 목표는 원하는 DNA 구조물을 박테리아 염색체의 미리 정해진 로커스(locus)에 통합하는 것입니다. 이는 조작된 4가지 박테리아 균주를 이용한 교배 프로토콜을 통해 수행됩니다. 수용 균주는 염색체 내에 통합된 spectinomycin 내성 유전자와 ATP 사이트(site)로 둘러싸인 e coli beta glucuronidase 유전자로 구성된 랜딩 패드(landing pad) 서열을 가지고 있습니다.

P JH one 10 공여 균주는 stuffer 적색 형광 단백질 유전자를 양측에서 둘러싼 B 사이트와 항생제 내성 유전자를 포함하는 플라스미드를 보유하고 있습니다. PJC two 공여 균주는 LAC 프로모터의 제어 하에 있는 streptomyces 파지 C 31 유래의 부위 특이적 인테그라제(site-specific integrase)를 포함하는 플라스미드를 보유하고 있습니다. 네 번째 균주인 MT 616은 세포 간 플라스미드 전이인 접합에 필요한 전이 유전자를 제공하여, 수 recipient 균주를 통한 trans의 생성을 가능하게 합니다.

인테그레이스 매개 카세트 교환(integrase mediated cassette exchange)에 필요한 두 가지 플라스미드의 획득. PJ H one 10 플라스미드의 공여 카세트를 염색체 상의 랜딩 패드 카세트 마커와 교환하면, 결과적으로 전이 이식체(trans immigrant)에서 랜딩 패드 마커인 SPR 및 UIDA는 소실되고 공여 카세트의 RFP 및 GMR은 유지됩니다. 상동 재조합과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 프로토콜의 간편함과 효율성입니다.

또한 이는 다양한 범위의 박테리아로 전이 가능합니다. 본 영상에서 사용된 수용 균주는 S milli latte 균주입니다. trans integrins를 생성하기 위한 교배 절차 2일 전, 단일 콜로니를 spect mycin이 함유된 5 mL TY 배지에 접종합니다. S milli 균주를 30 °C에서 2일 동안 진탕 배양합니다. 교배 절차 전날, 다음의 E. coli 균주들을 각각 적절한 항생제가 첨가된 5 mL LB 액체 배지에 접종합니다. integrase 발현 플라스미드를 포함하는 DH5α는 tetracycline 함유 배지에, mobilizer인 MT616은 chloramphenicol 함유 배지에, 그리고 donor cassette 플라스미드를 포함하는 DH5α는 Gentamycin 함유 배지에 접종합니다. 교배 절차를 위한 세포 준비를 위해, 세 가지 E. coli 균주를 37 °C에서 하룻밤 동안 지속적으로 진탕 배양합니다. 네 가지 배양액에서 각각 1.5 mL를 튜브에 옮기고 17,000 ×g에서 30초 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다. 배지를 제거하고 각 세포 펠릿을 1 mL의 멸균된 0.85% sodium chloride에 재현탁합니다. 상층액을 제거한 후 튜브를 다시 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 각 펠릿을 100 µL의 멸균된 0.85% sodium chloride에 재현탁합니다. 세척된 각 균주 배양액 10 µL를 일반 TY 한천 배지 플레이트에 각각 점적합니다.

이 지점들은 대조군 지점입니다. 다음으로, Pjc two를 포함하는 e coli DH five alpha를 제외한 각 균주 40 µL를 멸균 튜브에 넣고 피펫팅으로 혼합한 후, 이 혼합액 120 µL를 일반 TY agar 플레이트에 점적합니다. 이 지점은 integrase가 없는 음성 대조군입니다.

마지막으로, 멸균 튜브에 4가지 균주를 각각 40 µL씩 넣어 혼합한 후, 동일한 TDY 한천 배지에 이 혼합액 160 µL를 스폿팅합니다. 이 스폿은 인테그라제 매개 카세트 교환(integrase mediated cassette exchange) 접합 스폿입니다.

플레이트를 층류 후드(laminar flow hood)에 넣고 스팟이 약 20분 동안 마르도록 둡니다. 플레이트를 밀봉하고 교배 프로토콜 스트리킹 다음 날 30°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 두 개의 대조군 스팟과 IMCE 교배 스팟을 streptomycin과 gentamycin이 첨가된 TY agar 플레이트에 도말합니다.

S milli 수용 균주는 streptomycin에 대한 높은 수준의 내성을 부여하는 돌연변이를 보유하고 있어 IMCE 효율 계산에 사용됩니다. IMCE 교배 스폿의 약 4분의 1을 500 µL의 멸균된 0.85% Sodium chloride에 현탁하십시오. 10⁻⁷까지 10배 연속 희석을 수행하십시오. 전이 이주자(trans immigrants)를 선택하기 위해 streptomycin, gentamycin 및 xgl이 첨가된 TY agar 플레이트에 10⁻²부터 10⁻⁵까지의 희석액을 도말하십시오. 전이 이주자와 잠재적 수용균 모두를 선택하기 위해 streptomycin과 xgl이 첨가된 TY agar 플레이트에 10⁻³부터 10⁻⁷까지의 희석액을 도말하십시오. IE 총 수용균의 플레이트를 30 °C에서 3일 동안 배양하십시오.

녹색광 아래에서 RFP trans를 관찰하고 적색 필터를 통해 확인하십시오. 총 수용체(recipients)의 CFU 대비 trans 이주자의 CFU로 IMCE 효율 백분율을 계산하십시오. trans의 약 절반은 진정한 교환이 일어나 streptomycin과 Gentamycin이 첨가된 Ty 배지에서 3일간 배양한 후 흰색으로 변하며 감수성을 잃게 됩니다. 다음의 대조군 균주에서는 성장이 없어야 합니다: no integrase control s milli latte UW 2 27 control, e coli MT 616 control, P JH one 10 control을 포함하는 e coli DH five alpha control, 그리고 PJC two control을 포함하는 e coli DH five alpha control. 반면, 접합 지점(mating spot)의 IMCE 스트리킹은 첫 번째 스트리크에서 밀집된 성장이 나타나고 두 번째 스트리크에서 많은 콜로니가 형성되어야 합니다. 다음 두 이미지는 TY streptomycin xgl agar와 TY streptomycin Gentamycin xgl agar 상에서 접합 지점을 10⁻²로 희석하여 재현탁한 모습을 보여주며, 특히 TY streptomycin Gentamycin xgl agar 상의 결과가 포함되어 있습니다.

파란색 콜로니는 단일 재조합체입니다. 흰색 콜로니는 진정한 카세트 교환이 일어난 trans integrin이며, 녹색광과 적색 필터 하에서 관찰했을 때 TY strept cin xgl agar 상의 mating spot resus 현탁액 10⁻² 희석 지점은 형광이 나타나지 않는 경향을 보입니다. 반면, Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agar 상의 mating spot resus 현탁액 10⁻² 희석 지점은 두 단계의 형광을 나타냅니다.

더 밝은 콜로니는 청색 콜로니에 해당하며 RFP 발현이 더 높게 나타나는데, 이는 벡터 내의 LAC 프로모터로부터의 read through로 인한 것으로 추정됩니다. 덜 밝은 콜로니는 백색 콜로니에 해당하며, 이는 진정한 카세트 교환이 일어났고 LAC 프로모터의 read through 없이 직속 프로모터만을 가진 RFP를 포함하고 있음을 의미합니다. 이러한 경향의 콜로니들은 specks mycin에 민감해야 합니다.

전체 수용 세포 대비 트랜스 이주 세포의 백분율로 표현되는 트랜스 통합 효율은 0.5% 범위 내에 있어야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 당사의 엔지니어링된 균주를 이용한 세균 접합법을 사용하여 박테리아 염색체에 DNA 구조체를 삽입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.