DNA Double-Strand Break 분석을 위한 면역형광 현미경 검사

DNA 이중 가닥 절단에서 특정 DNA 손상 반응 단백질을 시각화하기 위해 DSB, 면역형광 현미경을 사용하는 부위는 DSB가 있는 인간 단핵 세포 단층을 포함하는 현미경 슬라이드로 시작합니다. 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다.

세포내 표적에 접근하기 위해 비이온성 세제, 투과성 막으로 처리합니다. 단백질 함유 차단 용액을 첨가하여 세포의 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 표적 반응 단백질에 결합하는 1차 항체와 함께 배양합니다.

단백질에 부착된 각각의 1차 항체에 특이적으로 결합하기 위해 서로 다른 형광단으로 태그된 2차 항체 혼합물로 처리합니다. DAPI로 DNA를 염색합니다. 장착 매체를 추가합니다. 커버슬립을 장착합니다.

형광 현미경 검사 중에 입사 광선은 여기 필터에 도달하여 특정 여기 파장의 빛이 통과할 수 있습니다. 이색성 거울(빔 스플리터)에 도달하면 여기광은 대물 렌즈를 향해 선택적으로 반사되어 빛을 샘플에 집중시킵니다.

입사 여기 광은 형광단의 전자를 더 높은 에너지 상태로 여기시킵니다. 바닥 상태로 돌아오면 전자는 더 긴 파장의 빛을 방출하여 대물 렌즈에 의해 수집되어 이색성 거울로 다시 전달됩니다.

거울은 방출 된 형광 빛이 방출 필터를 통과하도록 허용하여 원하는 형광 빛 만 검출기에 도달 할 수 있습니다. 이미지를 처리합니다. 다양한 색상의 형광 초점을 분석하여 DSB 부위에서 DNA 손상 반응 단백질의 공동 국소화를 시각화합니다.

각 준비에 대해 1 x 10⁵ 세포의 원심분리를 통해 환자 샘플의 단핵 세포로 2개의 사이토스핀을 준비합니다. 200마이크로리터의 4% PFA로 세포를 10분 동안 고정합니다.

고정 후, 셰이커에서 30밀리리터의 PBS로 세포를 각각 5분 동안 부드럽게 세 번 세척합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 0.1% Octoxinol-9로 세포를 10분 동안 투과화합니다. 실험실 셰이커에서 각각 5분 동안 30밀리리터의 5% 차단 용액으로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. 1시간 동안 30밀리리터의 신선한 5% 차단 용액으로 세포를 차단합니다.

4% 파라포름알데히드와 0.1% 옥톡시놀-9로 세포를 고정 및 투과화하면 감마 H2AX 및 53BP1 병소가 뚜렷하게 보존되었습니다.

세포의 한 제제를 마우스 단클론 항-감마 H2AX 항체와 함께 배양하고, 다른 한 가지 제제를 마우스 단클론 항-감마 H2AX 항체 및 다클론 토끼 항-53BP1 항체와 함께 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

입증된 항감마 H2AX 및 항53BP1 항체의 사용을 적극 권장합니다.

배양 후, 실험실 셰이커에서 5분마다 2% 차단 용액 30밀리리터로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다.

다음으로, 세포의 첫 번째 제제를 2% 차단 용액에서 1/500으로 희석한 Alexa488 접합 염소 항마우스 2차 항체와 함께 배양합니다. 세포의 두 번째 제제를 Alexa488 접합 염소 항마우스 2차 항체 및 Alexa555 접합 당나귀 항토끼 2차 항체를 2% 차단 용액에서 500분의 1로 희석한 배양합니다.

실험실 셰이커에서 30밀리리터의 PBS로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. PBS를 제거하고 마운팅 매체로 셀을 마운트합니다. 기포가 묻지 않도록 장착 매체 위에 커버슬립을 조심스럽게 놓으십시오. 형광 현미경으로 세포를 분석하기 전에 마운팅 매체가 굳을 때까지 최소 3시간 동안 기다리십시오.

마지막으로, 100배 대물렌즈 배율로 이미징하는 동안 DAPI, Alexa488 및 Cy3용 필터가 장착된 형광 현미경으로 세포핵의 감마 H2AX 및 53BP1 병소를 분석합니다.