Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

이 실험 절차의 전반적인 목표는 체내(in vivo) 인간 혈관 네트워크를 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 인간 혈액 유래 혈관 내피 전구세포(endothelial colony forming cells)와 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)를 배양합니다. 그 후 두 세포 유형을 콜라겐 기반 젤에 혼합하여 면역 결핍 마우스의 피하에 주입합니다.

7일 후, 임플란트를 회수하여 인간 혈관 네트워크의 형성 여부를 평가합니다. 최종적으로, 임플란트 내부의 인간 특이적 미세혈관의 존재는 조직학 및 면역조직화학 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 구성물을 외과적으로 이식하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 간단하고 수행하기 쉬우며, 수술이 필요하지 않다는 점입니다.

E CFCs 바이알 하나를 해동한 후, 즉시 10 mL의 DMEM이 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브에 세포를 희석합니다. 세포 현탁액을 1200 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고, 세포 펠릿을 10 mL의 가온된 EGM two 배지에 다시 현탁합니다. 그다음, 1% 젤라틴이 코팅된 100 mm 조직 배양 플레이트에 세포를 옮기고 가습 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 아침, 배지와 결합되지 않은 세포를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 결합된 세포에 10 milliliters의 신선한 E GM two 배지를 공급합니다. 세포가 합류 단층(confluent monolayer)을 형성할 때까지 향후 며칠 동안 이 과정을 반복합니다.

그다음 10 mL의 PBS로 세포를 세척합니다. PBS를 2 mL의 tripsin EDTA로 교체하고 플레이트를 인큐베이터에 넣어 5분 동안 둡니다. 5분 후 현미경으로 관찰하면서 플레이트를 가볍게 두드려 세포가 떨어졌는지 확인합니다.

그렇지 않은 경우, 부드럽게 흔들어주며 짧은 배양 과정을 반복합니다. 세포가 완전히 떨어져 나오면, 세포에 EGM two 배지 8 mL를 추가하고 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포 수를 측정하고 1200 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

이제 1% gelatin이 코팅된 조직 배양 플레이트에 cm²당 5,000 cells의 밀도로 세포를 분주합니다. EGM two medium에서 세포를 배양하며, 2~3일마다 EGM two medium으로 배지를 교체해 줍니다. 4대에서 8대 사이의 후속 계대 배양에서도 이 절차를 반복합니다.

E CFCs를 사용할 준비가 완료됩니다. 이 프로토콜은 MSC를 배양하는 데에도 사용할 수 있습니다. E GM two 배지를 M-S-C-G-M 배지로 교체하기만 하면 됩니다.

코팅되지 않은 배양 플레이트를 사용하십시오. 세포 밀도가 80%에 도달했을 때 계대 배양을 시작하며, cm²당 10,000 cells의 파종 밀도로 계대 배양하십시오. 본 실험에는 임플란트당 800,000 E CFCs와 1,200,000 MSCs가 필요합니다.

일반적으로 5개의 임플란트를 동시에 준비합니다. 먼저 배양 플레이트에서 세포 배지를 흡입하여 제거하고, 각 세포 플레이트를 10 milliliters의 PBS로 세척합니다. PBS를 2 milliliters의 trypsin EDTA로 교체하고 플레이트를 부드럽게 흔들어주며 배양합니다.

모든 세포가 떨어져 나갈 때까지 2~5분마다 현미경으로 세포를 확인하십시오. 그런 다음 DMEM 8 mL를 첨가하고 세포 용액을 수집하십시오. 15 mL 원추형 튜브에서 세포 수를 측정하고, 임플란트 5개 분량에 해당하는 세포를 별도의 15 mL 원추형 튜브로 옮기십시오.

그런 다음 세포를 1200 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 피브리노겐과 콜라겐 피브로넥틴 혼합물을 얼음 위에서 조심스럽게 준비합니다. 그다음 얼음처럼 차가운 혼합물에 세포 펠릿을 매우 부드럽게 재현탁합니다.

기포가 생기지 않도록 주의하며 세포 현탁액을 1 mL 주사기에 충전하고 캡이 씌워진 26 gauge 바늘을 장착합니다. 세포 혼합물을 주입할 때까지 충전된 주사기를 얼음 위에 보관합니다. ISO 불소 챔버를 사용하여 6주령의 무흉선 누드 면역결핍 마우스 4마리를 마취시켰습니다.

마우스가 마취되어 발가락 집기 자극에 반응이 없으면, 각 마우스에 대해 주입을 진행합니다. 30G 바늘을 사용하여 트롬빈 용액 50 µL를 상단 배부 영역에 피하 주사합니다. 동일한 위치에 세포 혼합물 200 µL를 주입합니다.

26 gauge 바늘을 사용하여 거대분자를 주입하면 젤화되어 피부 아래에 작지만 뚜렷한 혹이 형성됩니다. 주입 후에는 쥐가 편안함과 온기를 느낄 수 있도록 거즈 층 위에 놓아주십시오. 쥐가 다시 움직일 수 있을 때까지 관찰하십시오.

향후 3일 동안 동물의 전반적인 건강 상태를 매일 관찰하십시오. 주입 1주일 후, 이산화탄소로 마우스를 안락사시키고 수술적으로 젤 플러그를 제거합니다. 회수한 젤 플러그를 자와 함께 촬영한 다음, 각 젤 플러그를 조직학적 카세트에 넣고 10% neutral buffered formalin에 담가 실온에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

다음 날, 10% 중성 완충 포르말린을 증류수로 세척하여 제거합니다. 조직학적 평가 전까지 카세트를 4°C의 PBS에 보관하십시오. 파라핀에 매립된 임플란트를 7 µm 두께로 절편합니다.

그런 다음 이식물의 중앙 부위에서 미세혈관의 밀도를 정량화합니다. H&E 염색을 통해 제곱밀리미터당 혈관 수를 측정하여 미세혈관의 인간 유래 특성을 입증합니다. 절편을 시판되는 anti-human CD 31 항체를 1:100로 희석하여 염색합니다.

이 위상차 현미경 이미지는 제대혈 유래 eCFC의 전형적인 합류 단층(confluent monolayer)에서 나타나는 내피세포 특유의 자갈 모양(cobblestone) 형태를 보여줍니다. 이 이미지는 인간 골수 유래 MSC의 전형적인 방추형 형태를 보여줍니다. 마우스 숙주 내에서 일주일 동안 배양한 후, 노란색 점선으로 표시된 이식편은 고배율에서 숙주의 조직과 매우 다른 모습이었습니다.

적혈구를 포함하는 내강 구조가 확인된 여러 개의 미세혈관들이 노란색 화살표로 표시되어 있습니다. 플러그를 면역조직화학적으로 검사했을 때, 미세혈관의 내강은 인간 CD 31에 대한 단클론 항체에 반응하였습니다. 세포핵은 헤마틴으로 대조 염색되었습니다.

숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 기술을 1온스 이내로 완료할 수 있습니다.