CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

안녕하세요, 저는 하버드 MIT 보건과학 및 기술부(Division of Health Sciences and Technology)의 TI Mercy 교수님 연구팀에서 연구원으로 재직 중인 Richard Lin입니다. 제가 진행하고 있는 프로젝트는 자원이 제한된 환경에서 환자의 혈액 내 CD4 양성 및 C3 양성 T 림프구를 정량화하고 포획하는 것입니다.

제 바로 앞에 있는 것은 PDMS(Polymethylsiloxane)로 구성된 마이크로 유체 장치입니다. 이 장치의 채널 높이는 50 µm이며, 장치 내 총 부피는 10 µL입니다. 따라서 이는 T 헬퍼 림프구를 포집하는 데 사용할 매우 정밀한 장치입니다.

기본적으로 HIV 환자를 위한 진단 벤치마크입니다. 마이크로 유체 장치의 표면은 이미 단백질로 준비되었으며, 시린지에는 CD4 양성 항체가 들어 있습니다. 현재는 pH 7.4의 PBS 생물학적 완충액만 있는 상태이며, 이제 이를 채널로 흘려보내 과잉의 CD4 양성 항체를 씻어내겠습니다.

이 단계에서는 단순히 잔여물을 씻어내려는 것이며 유속이 크게 중요하지 않으므로, 유속을 조절할 필요가 없습니다. 이곳이 장치의 입구가 될 것이며, 제 왼쪽이자 여러분의 오른쪽 방향이 출구가 될 것입니다. 이제 과량의 항체 용액을 씻어내겠습니다. 출구 쪽을 보시면 유체가 흘러나오는 것을 알 수 있는데, 매우 적은 양이지만 자세히 보시면 튜빙을 통해 채널에서 유체가 배출되는 것을 확인하실 수 있습니다.

이제 과잉 항체 용액을 씻어냈으므로, 혈액을 주입할 준비를 할 수 있습니다. 먼저 입구에서 튜브를 분리하겠습니다. 이제 인혈(human blood), 전혈(whole blood)이 담긴 새 주사기를 준비하겠습니다.

따라서 이는 환자 샘플이 아니라, 미세유체 장치에 혈액을 주입하기 위해 준비하는 동안 사용하는 건강한 피험자의 샘플입니다. 이제 주사기를 주사기 펌프에 장착하겠습니다. 전원을 켜면 주사기의 유속을 확인할 수 있으며, 유속은 5 µL/min으로 설정했습니다.

이제 혈액 주입을 위한 준비를 하겠습니다. 시린지 펌프를 수직으로 배치할 것인데, 이는 혈구 세포가 침전되는 성질이 있어 세포가 채널 안으로 흘러 들어가게 하기 위함입니다. 따라서 세포가 튜빙 바로 근처인 바닥 쪽으로 침전되도록 하는 것이 좋습니다.

이제 모든 설정이 완료되었습니다. 제 장치의 부피는 10 µL당 10 µL입니다. 그리고 채널 벽으로 흘려보내고자 하는 부피 또한 10 µL입니다.

채널의 색상만으로 혈액이 충분히 흘러 들어갔는지 확인할 수 있습니다. 채널이 붉은색으로 완전히 채워지면 10 µL가 흘러 들어간 것이므로 시린지 범퍼를 멈춰야 합니다. 이제 시작 버튼을 누르면 작동하며, 때로는 혈액이 실제로 채널에 들어갈 때까지 시간이 걸리기도 합니다. 이는 주로 압력 때문입니다.

예를 들어, 주사기를 장착한 후, 튜브 내의 혈액을 조정하기 위해 상황에 따라 액체를 흡입하거나 주입하기도 합니다. 따라서 어느 정도 시간이 걸릴 수 있지만, 일단 채널로 펌핑이 시작되면 유속은 우리가 원하는 대로 분당 1 µL로 설정됩니다. 그러므로 여기서 약간의 인내심을 가지고 기다려야 하며, 때로는 혈액이 채널로 들어가기까지 2~3분 정도 기다려야 할 수도 있습니다.

현재 혈액이 채널로 들어가기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 따라서 장치가 거의 완전히 채워졌음을 알 수 있습니다. 이제 채널 내의 혈액을 씻어내기 위해 튜빙을 다시 PBS로 전환하겠습니다.

이를 위해 튜빙을 제거할 때와 동일한 과정을 반복하겠습니다. PBS의 흐름 속도를 계속 조절해야 하므로 시린지 펌프는 여전히 필요합니다. 하지만 더 이상 혈액을 흘려보내지 않으며 PBS에는 세포가 없으므로, 시린지 펌프를 굳이 수직 상태로 유지할 필요는 없습니다.

이제 모든 준비가 완료되었으므로, 장치 내의 혈액을 씻어내겠습니다. 여기 있는 sharp 버튼을 다시 누르겠습니다. 보시는 바와 같이, 장치가 점점 깨끗해지기 시작합니다. 가장자리에는 여전히 혈액이 약간 남아 있지만, 천천히 사라지고 있습니다.

혈액이 모두 제거되면, 유량을 분당 5 µL에서 20 µL로 높입니다. 이렇게 변경하는 이유는 혈액 내에 C4 양성 항원을 가진 세포 유형이 실제로 두 가지 존재하기 때문입니다. 그중 하나가 우리가 찾고자 하는 T helper 림프구입니다.

다른 하나는 우리가 단핵구라고 부르는 세포입니다. 우리는 장치가 단핵구와 T 도움 림프구를 모두 포착하는 것이 아니라, T 도움 림프구만을 특이적으로 포착하도록 해야 합니다. 이를 위해 유량을 증가시키는데, 이는 단핵구가 T 도움 세포보다 크기가 더 크기 때문입니다.

따라서 유속을 높이면, 크기가 더 큰 단핵구는 CD4 양성 T 헬퍼 세포보다 표면에서 떨어져 나가려는 더 큰 압력을 받게 됩니다. 현재 약 20분이 경과했습니다. 제가 지금 손에 들고 있는 것은 용액입니다.

이는 용혈 라이싱 솔루션(fax licensing solution)이라고 합니다. 이 솔루션의 목적은 적혈구를 용혈시키는 것입니다. 따라서 채널 내에 적혈구가 남아 있는 곳이라면 어디든 이 솔루션이 이를 용혈시킵니다.

이것은 스톡 용액으로부터 10배, 총 100배 희석된 것입니다. 이제 시린지 펌프를 멈추고 튜빙을 제거한 뒤, 기본적으로 용액을 이 시린지에 있는 것으로 교체하겠습니다. 이제 기계를 멈추고, 튜빙을 제거하고, 이것을 떼어낸 다음, 이 시린지를 사용하여 새것으로 교체하겠습니다.

이제 모든 준비가 되었으므로, 유량을 다시 5 µL/min으로 낮추겠습니다. 유량 설정을 20에서 5로 변경하고, 이제 fax license 용액을 20분 동안 흘려보내겠습니다. 이제 시작 버튼을 누릅니다.

현재 우리 앞에 보이는 것은 10배 배율로 촬영한 장치의 광학 이미지입니다. 여기 있는 모든 흰색 점들이 세포임을 알 수 있습니다. 그렇다면 이 세포들이 우리가 찾고 있는 세포라는 것을 어떻게 확인할 수 있을까요?

따라서 저희는 몇 가지 서로 다른 염색법을 사용하는데, 먼저 사용하는 염색법은 DPI라고 불리는 것으로, 이는 핵을 염색합니다. 기본적으로 백혈구와 같이 핵이 있는 모든 세포는 염색되는 반면, 핵이 없는 적혈구는 염색되지 않습니다. 이미지 전체에서 볼 수 있듯이, 모든 파란색 점들이 바로 그렇게 염색된 세포들입니다.

세포입니다. 이제 다음 단계는 세포가 이른바 C4 양성 항원을 가지고 있는지 확인하는 것입니다. 우리 장치의 전체 목적이 C4 양성 세포를 포집하는 것이므로 이는 매우 중요합니다.

다음으로, 저희가 사용하는 형광 항체는 당연히 C4 특이적 항체입니다. 다음 슬라이드로 넘어가겠습니다. 이 사진에서 세포들이 훨씬 더 어둡게 보이는 이유는 저희가 사용하는 형광 항체가 보통 4-팩스(4-facts)용이기 때문입니다.

따라서 희석 배수가 훨씬 높습니다. 하지만 자세히 살펴보면, 시야 전반에 여전히 점들이 흩어져 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이 점들은 상당히 희미합니다.

하지만 더 자세히 살펴보면 이 세포들이 CD4 양성임을 알 수 있으며, 이는 우리가 정확히 원하는 결과이므로 바람직합니다. 그리고 앞서 언급했듯이 다음 테스트 단계는 두 가지 서로 다른 유형의 CD4 양성 세포를 구분하는 것입니다. 하나는 우리가 원하는 T 도움 세포(T helper cells)이며, 다른 하나는 단핵구(monocytes)라고 불리는 세포들입니다.

따라서 두 세포를 구별하기 위해 또 다른 형광 항체가 필요합니다. T 도움 림프구에는 CD3 양성 항원이 존재하지만, 단핵구에는 존재하지 않는다는 점을 이용합니다.

다음으로 사용할 항체는 CD3 특이적 항체이며, 이 사진에서 확인할 수 있습니다. 다시 말씀드리면, 장치 곳곳에 점들이 흩어져 있는 것을 볼 수 있는데, 일부 세포는 더 밝게 빛나고 일부는 그렇지 않기 때문에 점들의 크기가 다르게 보일 수 있습니다. 즉, 이 경우에는 상당 부분 우연에 의한 것이지만, 대부분의 경우 이 밝은 빨간색 점들은 모두 세포입니다.

따라서 다시 한번 확인하고자 하는 것은, 첫째로 우리의 세포들이 CD4 양성이며 CD3 양성인지 확인하는 것입니다. 이 경우 많은 세포가 CD3 양성임을 알 수 있으며, 이는 매우 바람직합니다. 이를 통해 포획의 특이성을 확보할 수 있기 때문입니다.

크게 나타나는 부분들이 불순물일 수도 있지만, 많은 경우에 단순히 세포 하나에 CD3 플러시, 즉 CD3가 더 많이 결합된 상황이 발생하곤 합니다. 이 사진은 이 미세유체 장치를 통해 수집한 데이터 중 하나이며, 기본적으로 세포 캡처 프로(cell capture pro)입니다. 이전 슬라이드 등에서 보셨듯이, 세포가 포함된 사진이 많이 있었다는 것을 알 수 있습니다.

그렇다면 이들이 실제로 어떻게 축적될까요? 이들은 세포 포집 프로파일로 축적되며, 이 경우 X축에는 입구로부터의 거리를, Y축에는 포집된 세포 수를 표시할 수 있습니다. 장치 전체를 통해 초기 밀도는 매우 높았다가 서서히 감소하는 것을 알 수 있는데, 이는 혈류에서 C4 양성 및 C3 양성 세포를 포집함에 따라 혈액 샘플 내 해당 세포의 농도가 감소할 것이라는 예상과 일치하는 결과입니다.

그리고 이것이 기본적으로 저희의 데이터가 보통 제시되는 방식입니다.