림프구 아형(Lymphocyte subtype)을 특성화하기 위한 3차원 정량적 위상 이미징(Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging)

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

0 조회수 • 4:37 분 • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

림프구 하위 유형 현탁액을 이미징 챔버에 로드합니다.

챔버를 3D 정량적 위상 이미징 현미경 스테이지에 배치합니다.

최적의 이미징을 위해 현미경 매개변수와 초점면을 조정합니다.

림프구 이미징 중에 레이저 빔은 기준 빔과 샘플 빔으로 분할됩니다.

샘플 빔의 경로에 마이크로미러 어레이 (micromirror array) 를 특징으로하는 디지털 마이크로미러 장치 (Digital Micromirror Device) 를 사용하면 빔이 광축을 중심으로 360도 회전할 수 있습니다.

림프구를 통과하는 각 빔은 세포 내 굴절률 변화에 따라 위상 변이를 겪습니다.

결과 샘플과 기준 빔이 재결합되어 2D 홀로그램을 형성합니다.

다양한 각도의 위상 및 진폭 정보를 포함하는 홀로그램 시퀀스는 림프구 주위의 빔 회전을 통해 캡처됩니다.

림프구를 제외한 다양한 조명 각도를 가진 여러 배경 홀로그램을 획득합니다.

회절 단층 촬영 알고리즘을 사용하여 홀로그램을 3D 굴절률 단층 촬영으로 재구성하여 라벨링 없이 림프구의 형태학적 및 생화학적 정보를 제공합니다.

최적의 이미징을 위해 각 세포 샘플을 RPMI 배지 마이크로리터당 180개 세포의 농도로 희석하고 첫 번째 희석된 샘플 120마이크로리터를 이미징 챔버에 천천히 주입합니다. 챔버 내에 기포가 부족하다는 것을 확인한 후 3D 정량상 현미경의 대물 렌즈에 증류수 한 방울을 놓고 이미징 챔버를 현미경의 병진 스테이지에 놓습니다. 샘플이 대물 렌즈와 정렬되도록 스테이지를 조정하고 이미징 소프트웨어의 현미경 원근법의 보정 탭에서 초점 및 표면을 클릭하여 대물렌즈 및 콘덴서 렌즈의 축 위치를 각각 조정합니다.

자동 모드를 클릭하여 대물렌즈와 콘덴서 렌즈를 정렬합니다. 정렬을 최적화하려면 스캐닝 모드를 열고 렌즈를 수동으로 조정하여 디지털 마이크로미러 장치 패턴을 중앙에 정렬합니다. 그런 다음 일반 모드로 돌아가서 변환 단계를 조정하여 시야에서 셀을 찾습니다. 대물 렌즈의 축 위치를 조정하여 화면에 시각화된 샘플 경계가 거의 보이지 않을 때까지 초점면을 찾습니다.

최적의 3D RI 단층 촬영을 생성하려면 세포의 초점을 완벽하게 조정하는 것이 중요합니다. 이미지를 제대로 촬영하지 않으면 3D 재구성이 손상되어 단층촬영이 시끄러

워집니다.

변환 단계를 조정하여 셀이 없는 위치를 찾고 보정을 클릭하여 다양한 조명 각도로 여러 2D 홀로그램을 측정합니다. 변환 단계를 조정하여 시야 중앙에 있는 셀을 찾고 획득 탭에서 이미징 중인 샘플의 이름을 지정합니다.

3D 스냅샷을 클릭하여 방금 측정한 2D 홀로그램과 동일한 조명 각도를 사용하여 셀의 홀로그램을 측정합니다. 수집한 데이터가 데이터 관리 패널에 나타나면 데이터를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 프로세스를 클릭하여 이미징 소프트웨어에 구현된 회절 단층 촬영 알고리즘을 사용하여 2D 홀로그램에서 3D 굴절률 단층 촬영을 재구성합니다. 이미징 후 데이터 관리 패널에서 데이터를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 열기를 클릭하여 데이터를 시각화합니다.

셀의 중심을 클릭하여 위치를 변경하고 데이터 관리자 패널에서 RI 단층 촬영을 클릭합니다. Preset 탭에서 Load를 클릭하고 3D RI 분포에 따라 단층 촬영을 시각화하기 위해 이미징 소프트웨어에서 제공하는 사전 정의된 전달 함수인 lymphocytes.xml를 두 번 클릭합니다. 마우스를 스크롤하여 확대하고 셀을 드래그하여 원하는 방향으로 회전합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026