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병원성 기생충에 감염된 고정 및 투과화된 상피 세포로 시작합니다.
비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 완충액을 추가합니다.
기
생충의 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 마우스 다클론 1차 항체와 오버레이합니다.
기생 단백질 결합 1차 항체와 상호 작용하는 원적외선 형광단 표지 2차 항체를 추가합니다.
결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오. 1차 항체에 결합하는 항마우스 항체로 차단하여 숙주 단백질 표지 중 교차 반응성을 최소화합니다.
상피 세포 내에서 숙주 리보핵단백질을 표적으로 하는 마우스 단클론 1차 항체를 추가합니다.
녹색 형광단 표지 2차 항체와 적색 형광단 접합 팔로이딘의 혼합물로 오버레이하여 각각 숙주 단백질 결합 1차 항체 및 액틴의 표지를 용이
하게 합니다.
완충액으로 씻으십시오. DNA 염색 함유 배지를 사용하여 마운트하여 숙주 핵, 기생충 핵 및 키네토플라스트에 파란색 착색을 부여합니다.
공초점 현미경을 사용하여 샘플을 분석합니다. 이중 표지 면역형광 기술은 녹색 숙주 단백질과 적색 기생 단백질을 보여 정확한 세포 내 국소화를 가능하게 합니다.
UV 멸균된 둥근 커버슬립이 포함된 24웰 플레이트에 LLC-MK2 세포를 넣고 16시간 동안 침전시킵니다. 그런 다음 세포를 감염시키기 위해 T. cruzi를 함유한 상청액을 각 웰에 첨가하고 6시간 동안 배양합니다. 다음으로, 감염된 세포와 감염되지 않은 세포가 포함된 커버슬립을 PBS로 5회 세척합니다.
그런 다음 세포를 2% 파라포름알데히드와 PBS로 고정합니다. 10분 후 커버슬립을 PBS로 각각 5분씩 3회 세척한 후 비이온성 세제로 커버슬립을 10분 동안 투과시킵니다.
5분 PBS 세척 3회 후, 커버슬립을 차단 용액에서 30분 동안 배양한 후 마우스 단클론 또는 다클론 항체와 함께 또 다른 30분 배양합니다. 세척 후, 커버슬립을 차단 용액 및 팔로이딘에 2차 항체와 함께 30분 동안 배양하여 숙주 세포의 액틴 필라멘트를 염색합니다.
그런 다음 커버슬립을 PBS로 다시 세 번 세척한 후 DAPI 배지가 포함된 소량의 퇴색 방지 마운팅 시약을 슬라이드 표면에 도포합니다. 집게를 사용하여 기포 형성을 방지하기 위해 매체에서 커버슬립을 부드럽게 기울입니다.
이중 라벨링의 경우, 앞서 설명한 대로 커버슬립과 블로킹 용액을 배양한 후, 마우스 다클론 항체에서 30분 동안 배양한다. 다음으로, 커버슬립을 PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척한 후 2차 항체와 함께 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 세 번의 PBS 세척 후, 차단 용액에 희석된 AffiniPure 토끼 항마우스 IgG로 두 번째 차단 단계를 수행합니다. 30분 후, 커버슬립을 PBS로 다시 세척한 후 마우스 단클론 항체와 함께 30분 더 배양합니다.
다음으로, 3번의 PBS 세척 후, 표지표를 염소 항마우스 IgG2b 항체 및 팔로이딘과 함께 배양합니다. 그런 다음 PBS 세척 3회 후 앞서 설명한 대로 변색 방지 마운팅 시약을 도포합니다.