히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

이 영상은 핵산 조성에 기반하여 혼합 바이러스 군집을 분리하는 절차를 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 바이러스 군집의 분류학적 다양성과 기능적 잠재력을 연구할 수 있습니다. 여기서는 인산 칼슘의 결정 형태인 하이드록시아파타이트가 핵산 분리에 사용됩니다.

먼저, Hydroxyapatite 컬럼을 충전하고 평형화한 후 정제된 바이러스 핵산을 컬럼에 적용합니다. Hydroxyapatite의 양전하를 띤 칼슘 이온과 핵산 아형의 음전하를 띤 인산 골격 사이의 전하 상호작용을 통해 핵산이 컬럼에 결합됩니다. 다음으로 단일 가닥 DNA/RNA 및 이중 가닥 DNA를 서로 다른 농도의 인산염 완충액으로 순차적으로 용리합니다. 이렇게 얻은 핵산은 탈염 및 농축 과정을 거쳐 시각화, 정량화 및 DNA 시퀀싱을 통한 식별 준비를 합니다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 핵산 종이 9% 미만의 carryover로 분리될 수 있음을 확인합니다.

따라서 이 방법을 통해 바이러스 군집의 다양성과 기능적 용량을 평가할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 j Craig Venture Institute의 Shannon Williamson 박사 연구실 연구원으로 근무하고 있는 Doug Fro입니다. 오늘은 환경 바이러스 어셈블리지에서 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 RNA를 분리하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 방법은 DNA 또는 RNA를 대상으로 하는 핵 처리와 같은 기존 방법보다 장점이 있습니다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피는 전체 바이러스 군집을 포집할 수 있는 능력이 있습니다. 이 방법을 통해 바이러스 생태학 분야의 여러 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

예를 들어, 전체 유전자 보충물이나 바이러스 커뮤니티의 다양성은 어느 정도일까요? 저희는 유전적 특징의 일부를 희생시키지 않고 체사피크만(Chesapeake Bay)의 전체 리오 플랑크톤(Rio Plankton) 군집을 연구하고자 했을 때 처음으로 이 방법을 생각했습니다. 이 실험에 필요한 용액들은 함께 제공된 서면 프로토콜의 지침에 따라 미리 준비해야 하며, 여기에는 0.12 molar 인산염 완충액, 0.20 molar 인산염 완충액, 0.40 molar 인산염 완충액 및 1 molar 인산염 용액이 포함됩니다.

pH 6.8 및 수화된 하이드록시아파타이트(hydrated hydroxyapatite) 조건 하에, 실험 당일 모든 인산염 완충액과 수화된 하이드록시아파타이트를 60°C 항온 수조에 넣어 평형을 맞춥니다. 바이러스 핵산을 분리하는 데 사용할 econo 컬럼을 준비함으로써 이 절차를 시작합니다. econo 컬럼 끝에 스톱콕(stopcock)을 부착하고 그것이 닫혀 있는지 확인하십시오.

피펫을 사용하여 컬럼에 탈이온수를 넣은 다음, 컬럼 상단에 캡을 닫고 컬럼을 반복적으로 뒤집어 헹굽니다. 물을 따라내고 이 세척 과정을 여러 번 반복합니다. 그 다음, econ 컬럼에서 스톱콕을 분리하여 오토클레이브로 멸균합니다.

스톱콕(stop cock)은 녹을 수 있으므로 오토클레이브 멸균을 하지 않습니다. 스톱콕을 이온수로 헹군 다음, 다시 70% ethanol로 헹구고 오토클레이브 멸균 후 공기 중에서 건조시킵니다. 스톱콕을 다시 장착하고 닫습니다.

다음으로, 흄 후드 내에서 컬럼에 sigma coat 1 mL를 첨가하고, 여기에서 보여주는 것처럼 컬럼을 회전시키며 뒤집어 컬럼 유리를 코팅합니다. sigma coat로 코팅하면 핵산이 유리 표면에 흡착되는 것을 최소화할 수 있습니다. 분리 과정 동안, 일부 염 유리 표면이 코팅되었습니다.

스톱콕을 열고 원뿔형 튜브에 옮겨 담습니다. 다음으로, 컬럼을 순환식 항온수조에 연결하기 위해 두 개의 클램프를 사용하여 컬럼을 링 스탠드에 고정합니다. 순환식 항온수조에서 실리콘 튜브를 연결하여, 수조에서 나오는 물이 아래에서 위로 흐르도록 합니다.

온도를 60 °C로 설정하고 순환을 시작합니다. 실제 실험에서는 열 손실을 최소화하기 위해 컬럼과 튜브를 알루미늄 호일이나 폼 파이프 단열재와 같은 단열제로 감싸지만, 이 단계는 여기에서 생략되었습니다.

절차를 더 잘 시각화하기 위해 스톱콕(stop cock)을 닫으십시오. 피펫을 사용하여 멸균된 RNase-free water 10 milliliters를 첨가합니다. 스톱콕을 열어 물을 배출시키십시오.

그 다음 두 번째 세척 단계에 따라 다시 세척합니다. 10 mL의 멸균된 RNase-free 0.12 M 인산염 완충액으로 두 번 헹구고, 세척 단계 사이에 액체를 따라내어 제거합니다. 이제 컬럼이 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 위한 준비가 되었습니다.

econ 컬럼의 스톱콕이 닫혀 있는지 확인하십시오. 그런 다음 멸균된 2 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 준비된 재현탁된 재수화 하이드록시아파타이트 2 mL를 컬럼 바닥에 천천히 첨가하십시오. 컬럼 캡을 다시 닫으십시오.

하이드록시아파타이트가 중력에 의해 30분 동안 가라앉도록 둡니다. 이 방법은 세부 사항에 주의를 기울여야 합니다. 하이드록시아파타이트 컬럼은 분당 0.25에서 0.5 mL의 속도로 처리됩니다.

따라서 컬럼이 마르지 않도록 세심히 관찰하는 것이 매우 중요합니다. 30분이 지나면 스톱콕을 열어 버퍼를 폐기물 용기에 배출하십시오. 스톱콕을 닫고 통과액을 폐기하십시오.

핵산을 0.12 M 인산 완충액과 혼합하여 최종 부피 500 µL로 맞춘 후, 60 °C에서 10분 동안 배양합니다. 이렇게 하면 핵산이 컬럼의 온도와 평형을 이루게 되며, 존재할 수 있는 2차 구조를 제거함으로써 서로 다른 핵산 종의 분리 효율을 높일 수 있습니다. 2 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 컬럼을 흔들지 않도록 주의하며 핵산 용액을 하이드록시아파타이트에 빠르게 도포합니다.

500 µL 전체가 컬럼으로 흐르면, 컬럼이 마르는 것을 방지하기 위해 0.12 M 인산염 완충액을 컬럼 상단에 소량 추가할 수 있습니다. 핵산이 하이드록시아파타이트에 결합할 수 있도록 30분 동안 둡니다. 결합 배양 후, 컬럼 아래에 15 mL 원추형 튜브를 배치합니다.

그런 다음 스톱콕(stop cock)을 열고 단일 가닥 DNA가 포함된 초기 500 µL 샘플을 수집합니다. 500 µL가 수집되면 스톱콕을 닫습니다. 다음으로, 컬럼이 흔들리지 않도록 주의하면서 하이드록시아파타이트(hydroxy appetite)에 0.12 M 인산 완충액 6 mL를 첨가합니다.

그 다음 스톱콕을 열고 이전 단계에서 사용한 동일한 15 milliliter 튜브에 단일 가닥 DNA가 포함된 통과액을 계속 수집합니다. 약 6 milliliter가 수집되면 스톱콕을 닫습니다. 튜브에 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 용액을 동일한 부피만큼 첨가하고 볼텍싱으로 세게 혼합한 다음, 3,500 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 튜브에는 두 개의 층이 형성됩니다. 단일 가닥 DNA가 포함된 상층액 층을 새로운 15 mL 튜브로 옮기고, 상온에서 보관하십시오. 컬럼에서 RNA를 용출하고 정제하려면 0.20 M 인산염 완충액 6 mL를 첨가하고, 새로운 15 mL 튜브를 사용하기 전에 통과액을 수집하십시오. 그 후 페놀-클로로포름 추출을 수행합니다.

단일 가닥 DNA 샘플의 경우, 0.40 M 인산염 완충액 6 mL를 사용하여 컬럼에서 이중 가닥 DNA를 용출 및 정제하는 과정을 반복합니다. 마지막으로, 컬럼에 남아 있는 잔류 이중 가닥 DNA를 완전히 제거하기 위해 이 과정을 한 번 더 반복합니다.

이번에는 1.00 M 인산염 완충액 6 mL를 사용하여 핵산 샘플을 탈염합니다. 각 샘플 4~5 mL를 30,000 분자량 컷오프 초여과 세포막이 장착된 Ultra-4 원심분리 필터 장치로 옮깁니다. 고정각 로터를 사용하여 30 °C에서 6,000 xg로 약 5분 동안 원심분리하여 샘플을 500 µL 미만으로 농축합니다. 여과액을 버린 후, 남은 샘플을 필터에 추가합니다.

RNase-free 1X TE buffer를 사용하여 부피를 4~5 mL까지 맞춥니다. 그다음 농축된 부피가 될 때까지 다시 원심분리합니다. 원심분리 후 약 5분이 지나면, 필터에 RNase-free 1X TE buffer 4~5 mL를 추가하여 농축합니다.

핵산 샘플의 염을 완전히 제거하기 위해 이 세척 과정을 추가로 5회 더 반복합니다. 샘플이 완전히 농축되고 탈염되면, 남은 핵산 샘플을 멸균된 1.7 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 부피의 1/10에 해당하는 sodium acetate, 2배 부피의 100% ethanol 및 1 microliter의 glyco blue를 첨가하고 볼텍싱으로 잘 혼합한 후 원심분리하여 핵산을 침전시킵니다.

4°C에서 28,000 xg로 60분 동안 원심분리합니다. 이때 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.

300 µL의 70% ethanol을 첨가하고 실온에서 28,000 g로 10분간 원심 분리합니다. 완전히 말리지 않은 상태에서 각 분획을 적절한 부피의 RNase-free TE buffer에 재현탁합니다. 바이러스 핵산인 M13 MP18 단일 가닥 DNA, MS2 단일 가닥 RNA, F-specific 이중 가닥 RNA 및 lambda 이중 가닥 DNA를 동일한 농도로 혼합한 후, 본 비디오에서 보여주는 것과 같이 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 분리하였습니다. 레인 6에 표시된 것과 같이 동일한 농도의 M13 MP18 단일 가닥 DNA, MS2 단일 가닥 RNA, F-specific 이중 가닥 RNA 및 lambda 이중 가닥 DNA를 혼합하여 여기 보이는 하이드록시아파타이트 컬럼에 로딩하였습니다.

단일 가닥 DNA/RNA와 이중 가닥 DNA를 0.12 M, 0.18 M, 0.40 M 및 1.00 M 인산염 완충액을 사용하여 하이드록시아파타이트 컬럼에서 독립적으로 용리하였습니다. 게놈 크기를 확인하기 위해 1 KB ladder를 사용하였습니다. 이러한 결과는 이 방법이 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 RNA를 성공적으로 분리할 수 있으며, 인접한 분획 간의 전이(carryover)가 9% 미만임을 나타냅니다.

이 방법은 여기서 보여주는 것과 같이 체사피크만(Chesapeake Bay) 내 바이러스 군집에서 분리한 핵산을 분리하는 데에도 사용되었습니다. 단일 가닥 DNA-RNA와 이중 가닥 DNA는 각각 0.12 M, 0.20 M, 0.40 M 또는 1.00 M의 인산 버퍼 농도를 사용하여 독립적으로 용출되었습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 핵산의 대략적인 분자량과 질량을 시각적으로 확인하기 위해 1번 레인에는 high mass DNA ladder를, 2번 레인에는 1 KB ladder를 사용하였으며, 이중 가닥 DNA가 체사피크만 바이러스 플랑크톤에서 추출된 주요 핵산 유형이었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 이용하여 혼합 바이러스 군집으로부터 핵산을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

여기에는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite) 컬럼 및 핵산의 준비, 다양한 농도의 인산염 완충액을 이용한 핵산의 분리 및 용출과 탈염, 그리고 분리 후 핵산의 농축 과정이 포함됩니다.