에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜

본 절차의 전반적인 목적은 표본으로 사용된 이상 개체의 중장 및 타액선 부위에서 말라리아, 기생충 및 모기 DNA를 추출하는 것입니다. 이를 위해 먼저 모기의 복부와 흉부 사이의 관절 부위를 정확하게 절단하여 중장과 타액선 부위를 분리합니다. 그 다음, 각 부위를 탈이온수에 넣고 개별적으로 분쇄합니다.

그 다음 조직 현탁액을 알칼리 처리 및 세척하여 세포 펠릿을 회수합니다. 마지막으로, 세포 펠릿을 재구성하여 가열한 후 DNA를 추출합니다. 결과적으로 PCR 및 대립유전자 특이적 제한 효소 절단을 통해 변이, 매개체 종 및 말라리아 감염 유전자형을 식별하는 템플릿으로 사용하기에 적합한 고품질의 모기 및 말라리아 기생충 DNA를 얻을 수 있습니다.

따라서 유기 용매 추출이나 분리법과 같은 기존 기술에 비해 이 매우 간단한 기술이 갖는 주요 장점은, 매우 적은 양의 안전하고 쉽게 구할 수 있는 시약을 사용하며 처리 시간 또한 훨씬 짧다는 점입니다. 모기 해부를 시작하려면, 모기를 작은 파라폼 조각 위에 놓고 해부 현미경으로 고정하십시오. 그 위에 탈이온수 한 방울을 떨어뜨려 덮어줍니다.

조직을 연하게 하기 위해 가슴과 배 사이의 관절 부위를 정확하게 절단하여, 배 부분으로부터 머리와 가슴을 분리합니다. 해부된 각 모기 부위를 모기 식별 번호와 신체 부위가 미리 라벨링된 깨끗한 멸균 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 파라필름을 제거하고 70% alcohol을 적신 킴와이프로 현미경 스테이지를 조심스럽게 닦아낸 후 다음 모기 시료로 진행합니다. 모기 DNA를 추출하기 위해, 먼저 시료 튜브에 20 microliters의 탈이온수를 피펫팅합니다.

그다음 피펫 팁을 사용하여 잠겨 있는 모기 절편을 갈아 균일한 현탁액으로 만듭니다. 샘플 균질액에 오토클레이브 멸균된 XPBS 1% saponin 용액 100 µL를 첨가하고 가볍게 볼텍싱하여 혼합합니다. 샘플을 실온에서 20분 동안 배양합니다.

다음으로 20,000 G에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하십시오. 펠렛을 100 µL의 1X PBS에 재부유시킨 후, 원심분리 과정을 반복하십시오.

멸균된 탈이온수 75 µL와 탈이온수에 현탁된 20% w/v Cellex 100 수지 현탁액 25 µL를 첨가하고, 분젠 버너로 화염 멸균한 멸균 23 gauge 피하 주사 바늘을 사용하여 펠릿을 부드럽게 볼텍싱하여 재현탁합니다. 샘플 튜브의 뚜껑에 구멍을 뚫습니다.

시료 현탁액을 가열 블록에서 10분 동안 가열합니다. 20,000 G에서 1분간 원심분리한 후, DNA 용액을 미리 라벨이 부착된 보관 바이알로 옮겨 PCR 반응의 템플릿으로 사용합니다. 이를 통해 추출된 DNA의 품질을 확인하고, 400 base pair 크기의 단편이 생성될 것으로 예상되는 절지동물 미토콘드리아 nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit four 유전자의 특정 영역을 증폭합니다. 다음으로 Ananais Gambia 종을 구분하기 위해, Ananais Gambia Sens Stricto의 경우 390 base pairs, Ananais api의 경우 315 base pairs 크기가 생성될 것으로 예상되는 intergenic spacer 영역의 SNP 인접 부위를 증폭합니다.

그런 다음 p falciparum 항엽산제 내성 다형성을 유전자형 분석합니다. 아미노산 코돈 16, 51, 59, 108 및 164를 둘러싼 영역을 증폭하기 위해 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행합니다. 기생충의 dihydro folate reductase 유전자에서 앰플리콘의 대립유전자 특이적 제한효소 절단을 수행하여 항엽산제 내성을 검출합니다.

관련 다형성. 2%AROS 겔 전기영동으로 반응을 확인하십시오. 모기 DNA 추출물 품질 분석, RABIS 분자 식별 및 p falciparum 유전형 분석의 PCR 어세이 결과 예시는 단순화된 Kelex 방법이 표준 salting out 프로토콜보다 단계가 적고 시간이 4분의 1 미만으로 소요됨에도 불구하고 유사한 결과를 생성하며, 각 추출물의 DNA 품질 또한 대등함을 보여줍니다. McNear의 카이제곱 검사 결과, 변이, Gambia 자매종 및 기생충 감염률에 대한 샘플 양성률에 통계적 차이가 없었다는 점은 놀라운 일이 아닙니다.

반응 혼합물에 BSA를 추가하면 간소화된 kelex 방식과 일반적인 salting out 프로토콜 모두에서 PCR 억제제가 제거되어 전반적으로 PCR 양성률이 증가합니다. 하지만 이러한 증가는 kelex 추출물의 DNA 품질을 제외하고는 통계적으로 유의미하지 않았습니다. 숙련된 경우, p falciparum 증폭 산물의 대립유전자 특이적 제한효소 소화를 통해 중장 및 타액선 말라리아 감염의 약제 내성 대립유전자에 대한 유전자형 분석이 가능합니다.

이 기술은 올바르게 수행될 경우 약 37분 정도에 완료될 수 있습니다.