일반 잉크젯 프린터를 사용하여 과도 세포막의 세공 만들기

본 절차의 전반적인 목표는 잉크젯 프린팅을 이용하여 세포막에 일시적인 기공을 형성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 표준 잉크젯 프린터를 개조합니다. 두 번째 단계로는 바이오 잉크를 주입할 수 있도록 기존의 프린터 잉크 카트리지를 비우고 세척합니다.

다음으로, 분석 대상 세포를 형광 표지된 액틴 단량체와 PBS 용액에 부유시켜 바이오 잉크 용액을 제조합니다. 마지막 단계는 수정된 프린터와 카트리지를 사용하여 현미경 슬라이드 위에 바이오 잉크를 프린팅하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 통해 Fluor four가 접합된 G actin 단량체가 일시적인 막 기공을 통해 프린팅된 세포 내로 유입되었음을 확인할 수 있습니다.

이 기술이 표준 형질전환 및 세포 미세주입 기술보다 갖는 주요 장점은 사용법이 간단하고 높은 세포 생존율을 얻을 수 있다는 점입니다. 이 기술은 유전학적 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 세포 생물물리학 및 조직 공학과 같은 다른 연구 분야에도 적용될 수 있습니다. 또한, 이 기술을 이용하면 세포 이동 과정 중 세포의 세포골격을 쉽게 관찰할 수 있습니다.

우리는 세포에 가해진 힘으로 인한 세포골격 배열의 변화를 시각화하고자 했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 우선 프린터 하단 베이스에서 플라스틱 클립의 잠금을 해제한 다음 상단 플라스틱 케이스를 천천히 들어 올리십시오. 그런 다음 버튼 디스플레이 라이트 패널을 프린터 메인보드에 연결된 상태로 둔 채 프린터 상단에서 분리하십시오.

Kim wipes와 에탄올을 사용하여 프린터 내부, 특히 잉크 카트리지가 안착되는 부위와 인쇄가 이루어지는 부위를 세척합니다. 다음으로 HP desk Jet 500의 용지 공급 장치에 전원을 공급하는 케이블의 위치를 확인합니다.

앞면 왼쪽에 있는 용지 트레이 바로 아래에서 메인보드와 연결된 케이블을 분리합니다. 이제 용지 감지 메커니즘을 찾아 인쇄 용지 공급 메커니즘 상단 뒤쪽에 있는 회색 플라스틱 레버에 와이어 루프를 고정하여 수동 핸들로 사용하고, 이곳에 스테이지를 배치합니다. 15개의 원심분리 튜브용 폼 배송 홀더를 사용하여 인쇄 용지 공급 메커니즘 앞쪽의 인쇄 영역에 여러 장의 현미경 슬라이드를 테이프로 고정함으로써, 인쇄하고자 하는 슬라이드가 카트리지 프린트 헤드 바로 아래 높이에 오도록 조절합니다.

마지막으로, 무균 상태를 유지하기 위해 프린터를 층류 후드(laminar flow hood) 내부에 배치하십시오. 먼저 카트리지를 포장에서 꺼내되, 프린터 접점과 프린트 헤드를 덮고 있는 보호 테이프는 그대로 둡니다. 핸드 헬드 로터리 절단 도구를 사용하여, 녹색 상단 부분에 장애물이 없도록 주의하며 클램프로 카트리지 본체를 고정하십시오.

카트리지의 녹색 상단 부분을 잘라내고, 저장소에 남아 있는 잉크를 모두 비운 다음, 프린터 접점과 프린트 헤드를 덮고 있는 플라스틱 보호 테이프를 제거하십시오. 이 과정에서 프린트 헤드로 물이 샐 수 있으나, 이는 카트리지에 아무런 영향을 주지 않습니다. 물이 깨끗하게 나오면 카트리지를 건조시키십시오.

청결한 프린팅 환경을 유지하기 위해, 먼저 카트리지를 탈이온수가 가득 담긴 비커에 완전히 담근 후 15분 동안 초음파 세척하십시오. 초음파 세척 후 카트리지를 꺼내어 과잉의 물기를 털어냅니다. 카트리지 내부에 70% ethanol을 분사하여 더욱 무균적인 환경을 조성하십시오.

목표 세포를 수확한 후, 15 mL 원추형 원심분리관에 5 mL의 신선한 배지를 넣고 상온에서 250 ×g로 5분간 원심분리합니다. 다음으로 배지를 흡입하여 제거한 후, 갓 조제한 형광 G-actin 스톡 용액을 사용하여 세포를 1 × 10⁵ cells/mL 농도로 재부유시킵니다. 바이오 잉크를 제작할 때, 250 µL의 바이오 잉크로 여기에 표시된 선 패턴의 커버슬립 3개를 프린팅할 수 있음에 유의하십시오. 프린터를 켜고 예열한 후, 원하는 프린팅 표면을 이곳에 배치합니다. 이전에 조립된 스테이지 중앙에는 22 mm × 22 mm 커버슬립이 사용됩니다.

다음으로, 드로잉 소프트웨어 프로그램을 열고 원하는 패턴을 선택하십시오. 이제 세포 현탁액 약 100~120 µL를 카트리지 구획 하단의 작은 원형 웰에 피펫으로 분주합니다. 프린터가 다시 예열되는 동안 파일을 인쇄하면, 카트리지가 준비 위치로 이동합니다.

카트리지가 잉크 드립 웰(ink drip well)의 약간 왼쪽에 위치하고 정지했을 때, 용지 공급 메커니즘의 와이어를 위로 당기면 인쇄가 시작됩니다. 프린터는 G actin 단량체 용액 내의 섬유아세포 세포 현탁액으로 구성된 바이오 잉크와 HP desk jet 500 프린터를 사용하여 인쇄 스테이지 중앙에 놓인 커버 슬립 위에 인쇄합니다.

HP 26 시리즈 내에서 잉크 카트리지 셀을 유리 현미경 커버 슬립 위에 프린팅하였습니다. 이 그림은 형광 액틴 단량체가 통합된 프린팅된 섬유아세포의 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 패턴은 이전 그림에서 현미경 슬라이드의 대부분에 걸쳐 프린팅 용액의 연속선을 생성하는 데 사용되었습니다.

이 그림에서는 바이오잉크와 세포가 상호 증착된 직선이 나타나 있습니다. 출력 직후에는 세포가 현탁된 바이오잉크 용액에 유리 과잉 형광 액틴 단량체가 포함되어 있어 배경 형광이 증가한다는 점에 유의하십시오. 출력 후 약 10분 동안 세포를 배양하면 슬라이드에 대한 부착이 촉진되어, 신선한 성장 배지로 기질에서 과잉 단량체 용액을 세척함으로써 배경 형광을 상당히 감소시킬 수 있습니다. 여기에는 국소 출력 구역에 출력된 3T3 섬유아세포의 대표 이미지가 나타나 있습니다. 출력 15분 후의 세포를 촬영한 이 형광 현미경 사진은 녹색의 G-actin, 청색의 핵, 그리고 G-actin과 핵 염색약의 중첩 이미지를 보여줍니다.

다음 두 이미지는 프린팅 3시간 후 선형 패턴으로 배열된 두 개의 섬유아세포를 형광 현미경으로 관찰한 모습입니다. 첫 번째 이미지는 세포 내부의 형광 표지된 actin 단량체를 보여줍니다. 두 번째 이미지는 형광 채널을 배경 이미지와 겹쳐 놓은 것으로, 왼쪽 하단 모서리에 일부 부유물이 있을 수 있으나 이는 형광을 띠지 않음을 보여줍니다.

마지막으로, 세포 프린팅을 통한 세포막 투과 없이 단량체가 세포막을 통과할 수 없음을 입증하기 위해, 형광 표지된 단량체와 함께 3시간 동안 배양한 비프린팅 세포 대조군을 제시합니다. 이 과정을 수행할 때는 프린터 막힘이 이 기술의 속도를 늦추는 문제 중 하나이므로, 여러 개의 카트리지를 세척하여 사용할 준비를 해두는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 표준 데스크톱 프린터를 살아있는 세포를 프린팅할 수 있도록 변환하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 이는 일시적인 막 힘(transient membrane force)을 생성하는 데 도움이 됩니다.