Zebrafish의 단세포 운명 매핑

다음 실험의 전반적인 목표는 제브라피쉬 배아의 선택된 단일 세포에 대해 운명 지도 작성(fate mapping) 및 계보 추적(lineage tracing)을 수행하는 것입니다. 이는 케이지드 플루오레세인(caged fluorescein)을 고분자량 덱스트란에 화학적으로 결합시켜 이루어집니다. 그런 다음, 준비된 케이지드 플루오레세인 덱스트란을 제브라피쉬 배아에 미세 주입하고, 이광자 흡수를 이용하여 선택된 세포 내에서 광활성화시킵니다.

배아의 광활성화 후, 활성화된 세포의 운명 지도를 작성하기 위해 uncaged fluorescein dextran을 검출하는 면역조직화학 분석을 수행합니다. 궁극적으로 이 방법은 광활성화된 단일 세포의 계통 기여도와 조직 내 위치를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 표준 형광 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 운명 지도 작성을 위해 단일 세포를 차별적으로 표지할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 미분화 전구세포가 어떻게 서로 다른 조직 유형에 기여할 수 있는지와 같은 발달 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 배아 장착 및 광활성화 단계는 텍스트 설명만으로는 학습하기 어렵기 때문에 시각적 시연이 매우 중요합니다. 시작하기 전에, caged fluorescein dextran을 합성하여 금속 박으로 감싼 튜브에 보관하십시오. 그런 다음 1~2세포 단계의 배아에 합성된 cage fluorescein dextran을 미세 주입하십시오.

배아가 적절한 발달 단계에 도달하면 코팅을 수행합니다. 그 다음, 광활성화를 위해 코팅된 배아를 저융점 아가로스(low melting agarose)에 마운트합니다. 아가로스가 응고되면 LSM 510 소프트웨어를 로드합니다.

백색광 빔 경로에 투명한 노란색 필터를 배치한 다음, 'scan new image'를 선택하고 'start expert mode'를 클릭합니다. 레이저 탭을 선택하고 아르곤 이온 및 Mi.Tai 레이저 광원을 켭니다. Mi.Tai 파장을 740 nm로 설정합니다.

다음으로, config 탭을 선택합니다. 아르곤 이온(argonne ion)과 mi tai 레이저의 광경로 설정을 구성합니다. 그런 다음 scan 탭을 선택합니다.

대물렌즈를 20배 0.8로 변경하십시오. 채널 탭에서 max set mode method는 line으로, 숫자는 1로 각각 설정하여 최대 스캔 속도를 지정하고, mi tai를 제외한 모든 레이저 광원을 선택 해제하십시오. 다음으로, 광학 빔 경로에 파워 미터를 배치한 후, con 버튼을 선택하여 연속 스캔을 활성화하십시오.

파워 미터에 표시되는 평균 레이저 출력이 47 milliwatts가 될 때까지 투과율(transmission percent)을 조정하십시오. 그런 다음 채널 탭 아래의 정지 버튼을 선택하여 스캔을 중단하십시오. mi tai 레이저 소스 선택을 해제하고 argonne iron을 선택하십시오.

그 다음 channels 탭 아래의 fast XY 버튼을 다시 선택하고, 핀홀을 조정하십시오. Argonne iron laser로 최상의 이미지 품질을 얻기 위해 detect gain, amplify a offset 및 amplify를 다시 조정하십시오. 스테이지 컨트롤러를 사용하여 활성화할 세포를 찾아 초점을 맞춘 후, stop 버튼을 클릭하십시오. crop 도구를 사용하여 활성화된 세포를 크롭하여 mode 탭 아래의 crop factor가 50에서 70으로 표시되도록 하십시오.

그런 다음 채널 탭 아래의 정지 버튼을 선택하여 스캔을 중단합니다. 모드 탭에서 argonne ion 레이저 선택을 해제하고 My Tai 레이저를 선택합니다. 스캔 속도를 31.46초로 설정합니다.

그런 다음 단일 버튼을 선택하여 선택한 세포의 케이지드 플루오레세인 덱스트란의 이광자 활성화를 위한 스캔을 시작합니다. 활성화 후, 채널 탭으로 이동하여 mi tai 레이저 선택을 해제하고 아르곤 이온 레이저를 다시 선택합니다. 그런 다음 모드에서 줌 배율을 1로 설정합니다. 다음으로.

속도(speed) 항목에서 max 버튼을 클릭하여 최대 스캔 속도로 설정하십시오. 광활성화 영역을 검토하려면 fast xy를 선택하십시오. 그런 다음 채널(channels) 탭을 선택하고 핀홀을 조정한 후 다시 검출하여, 광활성화 영역이 레이저로 인해 소실(ablation)되지 않았는지 확인하십시오.

동반된 원고에 기술된 프로토콜에 따라 언케이지드(uncaged) 플루오레세인 덱스트란 면역 검출을 위한 광활성 배아를 준비합니다. 배아를 PBT로 6회, AP 버퍼로 2회 세척합니다. 그 다음 배아를 AP 버퍼가 담긴 9웰 플레이트로 옮깁니다.

다음으로, AP 버퍼를 흡입하여 제거하고 N-B-T-B-C-I-P를 첨가합니다. N-B-T-B-C-I-P 용액을 흡입하여 제거함으로써 N-B-T-B-C-I-P 염색 발색을 중단시킵니다. 그 후 배아를 PBT로 세척합니다.

이제 배아를 회수하고 상온에서 5분 동안 회전 플랫폼 위에서 흔들어 줍니다. 그런 다음 PBT 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 마지막으로 배아를 0.6% 저융점 agarose에 고정시키고, 정립 복합 현미경을 사용하여 광활성 세포의 이미지를 획득합니다.

이 그림에서 왼쪽은 명시야 이미지이고 오른쪽은 광활성화 전, 케이지형 플루오레세인 덱스트란 가닥이 미세 주입된 제브라피시 배아의 형광 이미지입니다. 여기서 보듯, 왼쪽 명시야 이미지의 화살표로 표시된 체절 중 하나에서 740 nm의 파장, 31초의 스캔 시간, 47 mW의 평균 레이저 출력으로 배아를 광활성화했습니다. 오른쪽 그림에서는 광활성화 후 케이지가 해제된 플루오레세인 덱스트란으로부터 나오는 형광을 관찰할 수 있습니다.

측판 중배엽의 작은 영역에서 케이지가 제거된 fluorescein dextran의 면역 염색 결과가 나타나 있습니다. 10-somite 단계의 배아를 이전 그림과 동일한 레이저 파라미터로 광활성화한 후 면역 검출 절차를 진행하였습니다. 화살표로 표시된 활성화 영역은 본 절차를 통해 배경 염색이 최소화된 상태로 확인될 수 있습니다.

라벨링된 세포의 위치와 운명을 더 정확하게 특성화하기 위해 다양한 조직 특이적 마커에 대한 면역 염색과 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술을 통해 혈관 생물학 분야의 연구자들은 발달 중인 제브라피시 배아에서 정맥 전구세포의 동맥화 기원을 연구할 수 있는 길을 열 수 있습니다. NBT 및 BCIP와 같은 화학 시약을 사용할 때는 매우 위험할 수 있으므로 항상 장갑을 착용해야 한다는 점을 잊지 마십시오.