Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

본 동영상에서 보여주는 방법은 난할기 opus 배아의 운명 지도(fate map)를 이용하여 단일 포배 세포를 분리 배양함으로써, 배아의 운명이 내재적 지시 또는 외재적 지시에 의해 결정되는지 평가하는 것입니다. 먼저, 첫 번째 난할구가 동물극의 옅은 색소 영역을 이등분하는 2세포기 배아를 수집합니다. 이 배아들을 배양하여 16~32세포기에 도달하면, 투명대(vitel membrane)를 제거하고 선택한 세포 주변의 인접 세포들을 박리하여 제거합니다. 그 후, 박리된 포배 세포를 agar가 코팅된 배양 웰의 오목한 부분으로 옮겨 배양합니다.

외식편(explant)이 원하는 단계에 도달하면, 이를 회수하여 in situ hybridization, QPCR 또는 면역조직화학법을 이용해 유전자 또는 단백질 발현을 평가합니다. 배양, 대규모 배아 세포군 또는 오가노이드 배양과 같은 다른 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 계보 추적 연구를 통해 발달 운명이 알려진 단일 배아 전구세포를 추가 성장 인자나 주변 세포의 존재 없이도 배양할 수 있다는 점입니다. 따라서 세포 내재적 인자가 해당 전구세포가 특정 조직의 전구세포가 되도록 지시하는지, 아니면 주변 세포로부터의 신호가 필요한지를 직접 테스트할 수 있습니다.

Blairs의 해부와 배양 웰로의 이동은 실체 현미경 하에서 정밀한 조작이 필요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 영상에서는 해부 현미경을 사용하여 모체 유래 mRNA가 세포를 신경 운명으로 편향시키는지 확인하기 위해 이 방법을 시연하겠습니다. Illumina 연마 필름을 사용하여 핀셋 네 세트를 날카롭게 다듬으십시오.

포셉 한 쌍은 실험 과정 중 팁이 손상될 경우를 대비한 예비용으로 사용합니다. 포셉 4개 모두를 오토클레이브로 멸균한 후 멸균 용기에 보관하십시오. 0.1x 및 1.0x 농도의 modified Barth saline(MBS)를 각각 500 milliliters씩 제조하고 여과 멸균합니다. 이 용액들은 유리 스크류 캡 병에 담아 14 to 18 degrees Celsius에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 1x 배지 100 milliliters에 전기영동 등급의 agarose를 2% 농도로 준비하십시오. agarose를 녹이기 위해 오토클레이브를 사용하며, 이후 agarose가 필요할 때 액체 상태가 되도록 마이크로웨이브로 가열하여 액화시킵니다.

멸균된 24웰 배양 플레이트의 각 웰 바닥에 약 0.5 milliliters를 붓습니다. 이렇게 하면 임플란트가 플라스틱에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 2~360 millimeter 페트리 접시 2개의 바닥에 약 2~3 milliliters를 붓고 가볍게 돌려 골고루 분산시킵니다.

이것들은 해부 접시 역할을 하며, 아가로스(agarose)는 배아가 플라스틱에 달라붙는 것을 방지합니다. 배아의 막을 제거하고 아가로스가 식어 굳으면, 6인치 파스퇴르 피펫의 끝부분을 불꽃으로 가열하여 구형으로 녹입니다. 구형 부분을 짧게 다시 가열한 후, 배양 플레이트 웰 내의 아가로스 표면에 가볍게 접촉시킵니다.

이렇게 하면 X explan을 배치할 얕은 홈이 만들어집니다. 플레이트의 각 웰에 대해 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 배양 플레이트의 각 웰에 1 mL의 1x 멸균 배양 배지를 채웁니다.

그 다음, 포배(blastomere) 분리를 용이하게 하기 위해 해부 접시에 0.1 X MBS를 채웁니다. 해부 접시 준비가 완료되면, 젤리층을 제거한 수정란을 0.5 x 배양이 포함된 100 millimeter 페트리 접시로 옮깁니다. 즉시 사용하지 않는 수정란은 첫 번째 접시에서 2세포기 배아를 찾는 동안 14 °C에서 배양할 수 있습니다.

해부 현미경을 사용하여 첫 번째 페트리 접시에 있는 배아들을 관찰하고, 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 약 10개의 1세포 및 2세포 배아를 0.5 x 배양액이 채워진 별도의 접시로 옮깁니다. 페트리 접시를 14 °C 인큐베이터에 넣습니다. 세포의 발달 가능성을 정확하게 평가하는 이 분석법의 능력은 운명 지도(fate maps)를 기반으로 정확한 세포집단(blastomere)을 분리해내는 것에 달려 있습니다.

따라서 2세포기 단계에서 이후의 정상적인 난할 패턴에 부합하는 올바른 색소 침착 패턴을 가진 배아를 선택하는 것이 매우 중요합니다. 여기서 보여주는 바와 같이, 정상적인 난할은 종종 배아의 한쪽 면에서만 일어납니다.

공여 세포가 일반적인 부위에서 기원한 경우, 이러한 배아들은 여전히 공여체로 사용될 수 있습니다. 배아가 2세포기에 도달하면, 동물극의 옅은 색소 영역을 첫 번째 분열구가 이분하는 배아들을 별도의 접시에 분류하며, 해부할 수량보다 약 5배 더 많은 배아를 분류하십시오. 이들이 외편(explan)을 위한 공여체가 됩니다.

절차 전반에 걸쳐 남은 2세포기 배아 두 개를 공여 배아 옆의 별도 배양 접시에 보관하여, 절편의 단계를 설정하기 위한 형제 대조군으로 사용하십시오. 배아의 분류 및 절개 작업이 끝나면, 인큐베이터 내의 배양 접시를 다시 확인하여 더 많은 1세포기 및 2세포기 배아를 찾으십시오. 1세포기 배아가 분열하는 데 약 90분이 소요되므로, 이 작업은 난자 채취 후 최대 2시간까지 수행할 수 있습니다.

외배엽(explant)을 준비하기 위해 5~10개의 배아를 해부 접시에 넣습니다. 그런 다음 투명한 난황막을 포셉으로 잡을 수 있도록 첫 번째 배아의 위치를 조정합니다. 난황막은 보통 보이지 않으나, 배아 표면 위로 투명한 진주빛 공간이 형성되어 분리되어 있는 동물극 부위에서 잡을 수 있습니다.

한 손에 쥔 날카로운 핀셋을 사용하여, 해부할 배아(blaster)가 손상되지 않도록 배아에서 약간 떨어진 지점을 잡습니다. 그런 다음 다른 손에 쥔 날카로운 핀셋으로 첫 번째 핀셋 끝부분 근처의 막을 잡고, 양쪽으로 부드럽게 당겨 막을 벗겨냅니다. 막이 제거되면 배아가 평평하게 펴집니다.

다음으로, 핀셋으로 인접한 세포를 잡고 이 세포를 손잡이처럼 사용하여 다른 손에 든 핀셋이 분리하려는 세포에 직접 닿지 않도록 한 뒤, 대상 블래스토미어(blastomere) 주변의 나머지 인접 세포들을 조심스럽게 끌어내어 분리합니다. 동일한 운명을 공유하는 정중선 세포들을 대상으로 하는 경우, 이들을 한 쌍으로 묶어 함께 제거할 수 있습니다. 마지막으로, 손잡이 역할을 했던 세포를 분리해 냅니다.

멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 blastocyst 또는 embryo 쌍을 집어 올리되, 공기 방울이 생기거나 과도한 흡입이 일어나지 않도록 주의합니다. 파스퇴르 피펫의 팁을 X-plane 배양 접시 웰의 배양액 표면 아래에 위치시키고, blastocyst를 천천히 배출합니다. blastocyst는 중력에 의해 얕은 홈 안으로 미끄러져 들어가야 합니다.

배아 하나 이상에서 분리한 blastomeres를 배양액의 동일한 홈에 넣어 하나의 explant로 결합할 수 있습니다. 해부 접시에 남아 있는 배아들을 대상으로 이 과정을 하나씩 반복합니다. 배아 10개 정도를 처리하면 해부 접시가 세포 파편으로 가득 찰 것입니다.

이런 현상이 발생하면 다음 해부용 접시로 교체하십시오. 모든 해부가 완료되면 외배엽(explan)이 얕은 홈 안에 있는지 확인하십시오. 홈 안에 없다면, 70% Ethanol로 멸균하고 공기 건조시킨 헤어 루프(hair loop)를 사용하여 조심스럽게 홈 안으로 밀어 넣을 수 있습니다. 마지막 해부가 끝난 후 약 1시간 동안 벤치 위 실온에서 이식물을 배양하십시오.

멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 치유된 외식편 주변의 잔해물을 제거합니다. 외식편이 담긴 플레이트를 형제 대조군 배아가 들어 있는 페트리 접시 옆에 14 to 20 °C로 배양합니다. 형제 배아를 통해 blastema 외식편의 발달 단계를 확인할 수 있습니다.

배양 후 약 1~2시간이 지나면, 분리 배양된 할구들은 약 4회 분열하고 손상된 주변 세포로부터 남은 대부분의 잔해물을 탈락시킵니다. 20시간 후에는 작고 견고한 세포구를 형성합니다. 형제 세포들이 원하는 발달 단계에 도달하면, 분리 배양물을 회수하십시오.

일부 세포가 붕괴되더라도 이러한 외식편은 꽤 잘 생존합니다. 따라서 배양액에 혼탁한 덩어리가 있는 경우, 헤어 루프나 핀셋으로 탐색하여 내부에 건강한 외식편이 묻혀 있는지 확인합니다. 글라스 파스토 pipette을 사용하여 소량의 배양액과 함께 외식편을 집어 올린 후, 수행할 분석에 적합한 고정액 또는 용해 버퍼로 조심스럽게 배출합니다.

등쪽 blasphemer 두 마리 또는 배쪽 blasphemer 두 마리를 16세포기 단계에서 해부하여, 형제 배아가 초기 신경판 단계에 도달할 때까지 14 °C의 XMBS 한 곳에서 배양하였습니다. 각 샘플은 in situ hybridization을 통해 접합자 신경판 유전자 Sox two의 발현을 분석하였으며, 이는 청색 반응 생성물로 나타납니다.

본 분석 결과는 신경판의 전구체인 배아 등쪽의 대부분의 blasphemers가 SOX two를 자율적으로 발현할 수 있음을 보여줍니다. 즉, 배아의 다른 부위로부터 추가적인 신호 전달 없이도 발현이 가능합니다. SOX two를 발현하지 않는 blasphemers는 해부 당시 잘못 식별되었을 가능성이 있습니다.

이와 대조적으로, 복측 표피의 전구체인 복측 동물극 blastomeres는 SOX2를 발현하지 않습니다. 이러한 데이터는 배측 동물극 blastomeres가 신경 조직을 형성하는 내재적 능력을 갖춘 반면, 복측 동물극 blastomeres는 그렇지 않음을 나타냅니다. 일부 배측 explant는 또한 배측 중배엽 형성을 나타내는 신장된 형태를 보였습니다.

이러한 할구들은 또한 온전한 배아에서 신경판(neural plate)을 형성하며, 외배엽 배양 시 신경판 마커 단백질을 발현하여 모계 발현 신경 유전자의 내인성 수준을 변화시키는 효과를 테스트합니다. Fox D5 mRNA를 8세포기의 복측 전구 할구에 주입하였습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 복측 이식편의 대부분이 SOX2를 발현하였습니다.

반대로, 8세포기 배아의 등쪽 전구 세포에 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드를 주입하여 Fox D five의 내인성 수준을 감소시켰을 때, 소수의 등쪽 외배엽만이 SOX two를 발현했습니다. 이러한 실험 결과는 Fox D five의 모성 발현이 등쪽 전구 세포가 신경 운명을 획득하는 내재적 능력에 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 이 절차 외에도, 기능 획득을 위한 mRNA 또는 기능 상실을 위한 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드를 분리 예정인 배아에 주입하는 등의 다른 방법들을 통해 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

예를 들어, 세포가 특정 발달 운명을 결정짓는 내재적 능력에는 어떤 유전자들이 관여할까요? 또한, 정제된 인자를 배양액에 첨가함으로써 알려진 신호 전달 인자들을 테스트할 수 있습니다. 이러한 접근법은 개별 세포 덩어리를 온전한 배아의 새로운 위치로 이식하는 데에도 사용될 수 있습니다.

이 테스트는 이식된 세포가 원래의 발달 운명에 고정되었는지 여부를 확인하며, 이 정보는 다능성 배아 세포가 특정 조직의 전구세포로 분화하도록 결정되는 세포 기전을 정의하는 데 매우 중요합니다.