잘라내기 -로드 : 망막 뉴런 사이 간격 접합 추적 커플링의 범위를 검토​​를위한 유용한 도구

다음의 절단 로딩(cut loading) 실험의 전반적인 목적은 제어된 조명 조건 하에서 온전한 망막 내 뉴런 간의 갭 결합(gap junction) 추적자 결합 정도를 조사하는 것입니다. 첫 번째 단계는 세포막은 통과하지 못하지만 열려 있는 갭 결합 채널을 통해 확산될 수 있는 추적자 분자인 뉴로비오틴(neuro biotin) 용액에 담근 날카로운 칼날로 망막을 절단함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서 망막을 링거액(ringer's solution)에 배양하면, 열려 있는 갭 결합 채널을 통해 추적자가 확산됩니다.

갭 접합 결합(gap junction coupling)이 약한 경우, 뉴로 바이오틴 형광은 절단 부위 근처의 망막 뉴런에만 국한될 것입니다. 반대로, 갭 접합 결합이 강한 경우에는 절단 부위에서 멀리 떨어진 망막 뉴런에서도 형광이 검출될 것입니다. 기존 기술보다 컷 로딩(cut loading) 방식이 갖는 주요 장점은 온전한 망막 신경 조직 내의 세포체가 작은 뉴런에 더 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다.

또한, 절편 로딩 중의 조명 조건을 제어하는 것은 온전한 망막 조직 내 단일 뉴런의 전기생리학적 연구 중에 제어하는 것보다 더 쉽습니다. 전기적 기록 중에 사용되는 빛 자극 자체가 간극 결합(gap junction coupling)의 변화를 유도할 수 있으므로, 본 기술의 시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Chu Choi이 진행하겠습니다. 이 절차에서는 수술 전 최소 1시간 동안 금붕어를 낮 시간대에 지속적인 암흑 상태로 유지하며, 망막 조직이 고정될 때까지의 모든 후속 단계 또한 낮 시간의 지속적인 암흑 상태에서 수행합니다. 어항 물에 150 milligrams per liter methane sulfonate를 첨가하여 금붕어를 깊게 마취시킵니다.

그 다음, 연방 및 대학 지침에 따라 금붕어를 희생시키고 안구를 조심스럽게 적출합니다. 이어서 각 안구의 전방부를 제거합니다. 그런 다음 안구 후방부 위에 거름종이 한 조각을 올리고, 거름종이가 안구 후방부 아래에 오도록 거름종이와 안구를 뒤집습니다.

이제 암순응된 금붕어에서 공막과 색소상피를 포함한 안구 후방 조직을 조심스럽게 제거합니다. 미세 가위로 망막의 시신경을 절단합니다. 안구에서 온전한 신경망막을 박리한 후, 광수용체 층이 위로 향하도록 신경망막을 거름종이에 부착합니다. 그동안 마취 상태인 물고기를 6-웰 플레이트의 각 웰에 테스트 약물 포함 여부에 따라 5 mL의 탄산염 기반 링거 용액(산소 공급됨)과 함께 배치합니다.

지속적인 암실 상태에서 망막을 웰로 옮깁니다. 그런 다음 파라폼(paraform)으로 웰을 밀봉하고 조직을 30분 동안 배양합니다. 망막을 절단하기 직전에 0.5% neuro biotin을 링거액(ringer solution)에 녹여 100 µL의 추적자 용액을 준비합니다.

다음으로, neuro biotin 용액을 유리 페트리 접시에 넣습니다. 그다음 망막이 부착된 여과지를 종이 타월 위에서 가볍게 두드립니다. 과잉의 ringers 용액을 제거하기 위해, 면도날을 neuro biotin 용액에 담근 후 망막과 여과지를 수직 방사형으로 절개합니다.

그 후, 면도날을 neuro biotin 용액에 다시 담그고 망막을 두 번째로 절단합니다. 이 과정을 망막당 최대 4회 반복합니다. 이 단계에서 망막을 시험 약물이 포함되었거나 포함되지 않은 신선한 ringers medium으로 옮겨 15분 동안 로딩 및 확산이 이루어지도록 합니다.

신선한 Ringer 용액 또는 시험 약물이 포함되었거나 포함되지 않은 배지로 각각 5분씩 3회 세척합니다. 그 후, 실온에서 0.1 M 인산 완충액 내 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 망막을 1시간 동안 고정합니다. 이어서 망막을 0.1 M PBS로 세척하여 4°C 냉장고에 보관하며 하룻밤 동안 둡니다.

0.1 molar PBS 및 0.3% Triton X 100에 2% streptavidin Alexa 488을 최종 농도 10 micrograms per milliliter가 되도록 혼합하여 망막과 반응시킨 후 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 실온에서 0.1 molar PBS로 망막을 10분씩 총 3회 세척합니다.

PBS 내에서 필터 페이퍼로부터 망막을 분리합니다. 그 다음 미세 붓을 사용하여 vector shield 마운팅 용액이 도포된 슬라이드 위에 망막의 광수용체 쪽이 위로 향하게 마운트합니다. 슬라이드를 레이저 주사 공초점 현미경으로 옮기고, 모든 실험 조건에 대해 동일한 배율, 해상도 및 설정으로 사진을 촬영하여 서로 다른 실험 조건이 gap functional tracer 결합 정도에 미치는 영향에 대한 비교가 가능하도록 합니다.

선택적 도파민 D2 수용체 길항제가 존재할 때의 지속적 암흑 상태 낮 시간대와 비교하여, 지속적 암흑 상태 낮 시간대 동안의 광수용체 세포 추적자 결합 범위입니다. 두 이미지 모두 왼쪽의 면도날 절단 부위를 확인하십시오. 단일 이미지에 모든 표지 세포가 포함될 수 있으나, 관심 영역의 Z-스택을 수집하여 표시된 것과 같이 단일 이미지로 투영하는 것을 권장합니다.

Zack을 따라 순차적으로 이동함에 따른 광수용체 세포 추적자 결합의 범위를 보여줍니다. 이 이미지에서 면도날 절단면은 오른쪽에 있음에 유의하십시오. LSM 이미지 브라우저에서 추적자 결합 범위를 정량화하려면, 이미지를 연 후 export를 클릭하여 사진을 16비트 비압축 TIF 파일로 저장하십시오. NIH Image J 소프트웨어를 사용하여 이 TIFF 이미지에 스케일 바를 포함해야 합니다.

홀 마운트(hole mount) 망막의 저배율 이미지에서 Alexa 4 88로 표지된 뉴로-비오틴(neuro biotin)의 형광 강도를 측정합니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 TIFF 파일을 연 다음, 스케일 바에 해당하는 직선을 그립니다. 이어서 analyze, set scale로 이동하여 알려진 거리와 길이 단위를 입력합니다.

그런 다음 확인을 클릭합니다. 이제 형광 측정값을 밀리미터(mm)와 같은 보정된 단위로 표시할 수 있습니다. 이후 사각형 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 선택하십시오.

형광 피크가 선택 영역의 왼쪽 경계에 위치하도록 설정하십시오. 오른쪽 경계 근처에 형광 신호가 없는지 확인하십시오. 지속적인 암흑 상태에서 얻은 주간 대조군 데이터에 대해 analyze and plot profile을 클릭하십시오.

왼쪽에서 오른쪽으로 지수 감소 곡선이 표시됩니다. 그런 다음 팝업 창에서 복사를 클릭하고 엑셀(Excel)에 붙여넣으십시오. 이제 절단면으로부터의 거리와 거리의 함수로서의 형광 강도를 나타내는 두 개의 열이 생성됩니다.

비교를 위해, 위 단계들을 낮 동안 지속적인 암흑 상태에서 얻은 데이터로 반복합니다. spit bro가 있는 경우, 각 원시 형광 값을 최대 형광 값으로 나누어 상대적 형광 강도를 구합니다. 절단 부위로부터의 거리와 상대적 형광 강도에 해당하는 두 열을 복사하여 origin 소프트웨어에 붙여넣습니다.

이 단계들은 주간 대조군과 주간 분무군 모두에 대해 나타나 있습니다. 이 시점의 데이터를 사용하여 결과값을 지수 함수적 감쇄(exponential decay) 1번 함수로 피팅합니다. T-검정 또는 ANOVA를 사용하여 서로 다른 실험 조건에서의 시상수(space constant) 값들을 비교하십시오.

비교를 위해 주간 대조군, 주간 pip rone 및 야간 대조군 데이터의 지수 함수 및 통계 분석 결과가 제시되었습니다. 여기서는 컷 로딩(cut loading) 기법으로 확인한, 암적응된 금붕어 망막 내 광수용체 세포 추적자 결합 정도의 예시가 제시되어 있습니다: 주간 A, 야간 B, 그리고 선택적 도파민 D2 수용체 길항제인 one이 존재하는 상태의 주간 결과입니다. 모든 공초점 이미지는 비교를 위해 동일한 설정으로 촬영되었습니다.

이 그래프에서는 세 가지 실험 조건에 따른 형광 강도를 절단 부위로부터의 거리의 함수로 나타내고, 이를 지수 함수로 피팅하였습니다. 컷 로딩(cut loading) 기법은 여기서 세 가지 실험 조건에 대해 보여주는 것과 같이 공간 상수 값을 계산함으로써 갭 결합 추적자 커플링(gap junctional tracer coupling)의 정도를 정량화하는 데 사용됩니다. 컷 로딩 기법은 또한 망막 내의 다른 세포 유형 간 또는 다른 종의 세포 간 전기적 시냅스를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

예를 들어, 이 두 그림은 암적응 조건 하에서 절단 적재(cut loading) 후 neuro biotin의 확산에 따라 토끼의 A형 및 B형 수평세포가 상동 트레이서 결합(homologous tracer coupling)을 나타냄을 보여줍니다. 우리는 주간과 야간에 간상세포와 원추세포 사이의 간극결합(gap junctions)을 통한 트레이서 확산 정도를 연구하기 위해 절단 적재 기술을 사용했습니다. 또한, 이 기술은 다른 망막 뉴런 간의 트레이서 결합이 망막 시계나 특정 명암 조건에 의해 조절되는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.

또한 이를 사용하여 다른 뇌 영역에 있는 뉴런 간의 추적자 결합(tracer coupling)을 연구할 수도 있습니다.