GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

본 절차의 목적은 살아있는 혈관 내피 세포의 액틴 세포골격에서 나타나는 역동적인 변화를 관찰하는 것입니다. 먼저 인간 제대정맥 내피 세포에 A GFP beta actin 플라스미드를 transfection하고, 커버슬립 위에서 세포가 confluence 상태가 될 때까지 배양합니다. 그다음, 가열 스테이지와 알부민 생리적 염류 용액 주입 장치가 갖춰진 살아있는 세포 이미징 챔버에 커버슬립을 배치합니다.

마지막 단계는 약물 처리 전후의 타임랩스 이미지 캡처를 통해 선택된 세포 영역의 데이터를 획득하는 것입니다. Image J와 같은 이미징 소프트웨어를 이용한 Chime 그래프 분석을 통해 돌출부의 거리, 시간, 속도와 같은 국소적 lamely podia 돌출 및 시간에 따른 액틴 섬유의 움직임에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 면역형광 이미징과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 살아있는 세포 이미징을 통해 내피 세포 투과성을 결정하는 메커니즘 연구에 액틴 및 세포골격의 역동적인 특성을 통합할 수 있다는 점입니다.

고정 염색된 세포는 특정 시점의 스냅샷을 나타내며, 염증 매개체 처리 전후의 작용 및 세포골격 역학에 대한 정보 제공량이 적습니다. 생물학적 안전 작업대 내에서, 커버 슬립을 70% ethanol로 2분간 멸균한 후 공기 중에서 건조시킵니다. 각 커버 슬립을 10 centimeter 배양 플레이트에 배치하고, 커버 슬립의 가장자리에 닿지 않도록 중앙에 따뜻한 젤라틴 용액 300 microliters를 첨가합니다. 5분 후, 액체를 흡입하여 제거합니다.

이제 0.25% trypsin EDTA를 사용하여 confluent하게 배양된 인간 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, VE)를 수확합니다. 세포 수를 측정하고 원심분리를 통해 세포를 회수합니다. VE nuclear effector kit를 이용한 transfection 반응을 위해 상층액(supernatant media)을 가능한 한 많이 흡입하여 제거합니다.

세포 펠릿을 기본 핵 이펙터 용액(basic nuclear effector solution)에 재현탁하고 0.2~2 µg의 GFP beta actin 벡터 플라스미드를 첨가합니다. 세포 현탁액 100 µL를 핵 이펙터 qve로 옮깁니다. 덮개가 덮인 vete를 몇 번 톡톡 쳐서 Q vet 바닥과 트랜스펙션 샘플 사이에 기포가 없는지 확인합니다.

Q VET를 nuclear effector two 장치에 넣고, nuclear effector 키트의 트랜스퍼 피펫을 사용하여 500 µL의 가온된 EGM two MV 배지를 qve에 첨가한 후 프로그램 A 0 3 4를 실행합니다. 그 다음 혼합물을 마이크로 원심분리 튜브로 다시 옮겨 15분 동안 배양합니다. 형질전환된 VE 현탁액을 부드럽게 한 번 섞어준 뒤, 가장자리에 닿지 않도록 주의하며 300 µL의 현탁액을 젤라틴 코팅된 커버슬립 위에 분주합니다.

그런 다음 1~4시간 동안 배양합니다. 형질전환된 세포가 커버슬립에 부착되었는지 확인합니다. 이후 플레이트에 E GM two MV 배지 10 milliliters를 첨가하고, GFP 발현이 일어날 때까지 계속 배양합니다.

먼저, 알부민 생리식염수 용액 배지 또는 PSS를 중력 유동 시스템에 넣고 인라인 히터에 연결합니다. 이제 유량 조절기를 조정하여 약 40 milliliters per hour의 유량을 맞춥니다. 그다음 면봉으로 스톱콕을 닫아 흐름을 중단시킵니다.

다이아몬드 배스(diamond bath) 하단 바깥쪽 가장자리에 진공 그리스를 바릅니다. 이제 인큐베이터에서 형질전환된 배양물을 꺼냅니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 들어 올립니다.

그 다음 Kim wipe를 사용하여 바닥 슬라이드에 남은 과잉 EGM two MV 배지를 흡수시키고, 세포의 면이 위를 향하도록 배치합니다. 커버슬립 위에 다이아몬드 배스(diamond bath)를 덮어 챔버를 형성합니다. 챔버를 신속하게 스테이지 히터에 넣습니다.

챔버 위의 클램프를 조이고 플레이트에서 EGM two MV 배지 약 1 mL를 챔버로 피펫팅합니다. 이제 챔버 왼쪽의 홀더에 진공 호스를 연결하고, 인라인 히터의 A PSS 라인을 챔버 오른쪽의 채널에 연결합니다. 그런 다음 진공을 켜고 A PSS 라인을 열어 형질전환된 세포 위로 배스가 관류되도록 합니다.

또한 인라인 히터를 37 °C로 켭니다. 다음으로 가열 스테이지용 서미스터 프로브를 배스 가장자리에 넣고 스테이지 히터를 37 °C로 켭니다. 남아있는 EGM two MV 배지와 염분 축적물을 제거하기 위해, 70% ethanol에 적신 Kim wipe로 커버 슬립 하단을 조심스럽게 닦아낸 후 마른 Kim wipe로 닦습니다. 형질전환된 HU 세포를 30분 동안 평형화합니다.

코스를 고정합니다. 연구를 위해 선택된 배양 세포 영역에 초점을 맞춥니다. 세포 내 GFP Act in 신호 강도에 따라 카메라 노출 시간을 0.5초에서 2초 사이로 설정합니다.

또한 실험의 간격 및 지속 시간을 설정하십시오. 이제 실내 조명을 끈 상태에서 설정을 평가하기 위해 단일 이미지를 캡처하십시오. 필요한 이미지들이 생성되는지 모니터링하며 타임랩스 시리즈를 캡처하십시오.

일반적인 프로토콜에서는 테스트 약물을 추가하기 전 20~30분 동안 기저 이미지를 획득하고, 이후 0.5~4시간 동안 추가 이미지를 획득합니다. 마지막으로, 동반 텍스트에 상세히 설명된 바와 같이, CH 그래프 분석을 통해 lamelly podia의 돌출 거리, 지속성 및 속도를 평가합니다. 일반적인 실험에서 GFP actin은 형질전환된 VE의 50% 이상에서 무작위 방식으로 발현됩니다.

1분 간격으로 획득한 이 이미지들은 세포질 전체뿐만 아니라 필라멘트 구조 및 세포 가장자리를 따라 돌출된 국소적인 멜리포디아(meli podia) 내의 GFP actin을 포착했습니다. 세포 돌출부의 거리 지속성과 속도는 타임랩스 이미지 세트를 통해 정량화됩니다. chm 그래프 분석을 사용하여, 먼저 세포 가장자리에 대략적으로 수직인 단일 픽셀 선을 긋습니다.

이 영역은 타임랩스 세트의 각 이미지에서 추출되어 시간에 따른 해당 영역의 몽타주 또는 카임(chime) 그래프를 생성하는 데 사용됩니다. 여기 카임 그래프의 왼쪽에서 오른쪽 관점에서 볼 때, 돌출부는 세포 가장자리의 상향 이동으로 표시됩니다. 이러한 돌출부 중 하나의 가장자리에 선을 겹치면, 해당 선과 관련된 픽셀 데이터를 수집하여 돌출부 역학을 정량화할 수 있습니다. 카임 그래프에 나타난 돌출부의 총 개수를 통해 돌출 빈도를 추정할 수 있습니다.

본 분석은 세포 주변부에서 형성되어 세포 중심 방향으로 이동하다가 결국 분해되는 스트레스 섬유의 움직임을 묘사합니다. kymograph 상에서 스트레스 섬유는 세포질 영역의 연속적인 선으로 나타나며, 종종 세포 중심을 향해 오른쪽 아래로 이동하는 모습을 보입니다. 원래의 kymograph에서 섬유를 식별하기 어려운 경우, 언샤프 마스크(unsharp mask) 필터로 이미지를 선명하게 하며, 스트레스 섬유 위에 그은 선은 measure 기능을 이용한 픽셀 데이터 수집을 용이하게 합니다. 대안적으로, 식별된 스트레스 섬유의 시작점부터 끝점까지 선을 그어 섬유가 관찰된 기간 동안의 평균 픽셀 데이터를 산출합니다.

본 프레젠테이션에서는 Image J와 같은 소프트웨어를 이용한 그래프 분석을 통해 타임랩스 이미지 세트의 데이터를 분석하는 방법을 시연하였습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 형질전환된 내피세포의 라이브 셀 이미징을 사용하여 염증 매개체에 반응하는 액틴 세포골격 역학을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.