PDMS 장치 제작 및 표면 변경

제 이름은 Ken Kotz입니다. 저는 Massachusetts General Hospital 소속 Bio MAs Resource Center의 박사후 연구원입니다. 저의 주요 연구 프로젝트는 미세유체 구조를 갖춘 면역 친화성 캡처 장치를 사용하여 호중구를 분리하는 것입니다.

우리는 후속 게놈 분석을 위한 RNA 분리를 위해 전국 5곳의 서로 다른 병원에서 이 장치를 사용합니다. 기본적으로 실리콘 위에 SU-8 포토레지스트 마스터가 있는 구조입니다. 이 마스터 위에 2액형 엘라스토머인 PDMS를 부어 PDMS로 몰드를 형성할 것입니다.

마스터 몰드를 케이스에서 꺼내 페트리 접시에 넣습니다. 마스터 몰드를 페트리 접시 바닥에 테이프로 고정합니다. 저울을 사용하여 PDMS, 경화제 및 베이스 수지의 혼합물을 측정합니다.

배합비는 경화제 1 : 수지 10입니다. 일반적으로 절단된 장치의 경우, 수지 20~30g과 경화제 2~3g을 각각 측정하여 사용합니다. 소형 웨이 보트에 경화제와 수지를 모두 부은 후, 표준 플라스틱 포크를 사용하여 두 물질을 함께 혼합합니다.

경화제가 수지 내에 균일하게 분포되도록 세게 섞고 혼합물을 계속해서 겹쳐 접어주어야 합니다. 일반적으로 두 성분이 얼마나 잘 섞였는지를 확인하는데, 기포의 수를 통해 엘라스토머 전체에 작은 기포들이 고르게 분포되었는지 확인합니다.

그 다음, 페트리 접시에 들어있는 SU-8 마스터 위에 PDMS를 붓습니다. PDMS가 올려진 마스터를 진공 벨자(vacuum bell jar)에 넣고, 챔버 내부를 진공 상태로 만들어 혼입된 공기를 제거하는 탈기 과정을 거칩니다. 일반적으로 탈기 과정은 30분에서 1시간 정도 소요됩니다.

탈기 후, 진공 챔버에서 장치를 꺼내 65 to 80 °C의 오븐에 넣습니다. 이 온도에서의 최소 경화 시간은 3 to 6시간입니다. 본 실험실에서는 일반적으로 장치를 오븐에 넣어 밤새 경화시킵니다.

일반적으로 11번 수술용 스틸 나이프를 사용합니다. 실리콘 마스터 가장자리에서 약 0.5cm 깊이로 직선 절개를 하며, 마스터의 가장자리를 따라 잘라 큰 원반 모양으로 만듭니다. 마스터에서 PDMS 몰드를 떼어내어 패턴 면이 위로 향하게 하여 깨끗한 페트리 접시에 놓습니다.

분리된 몰드를 페트리 접시에서 꺼내어 나이프 또는 선형 레일에 장착된 나이프를 사용하여 절단 표면 위에 놓습니다. 몰드에 포함된 장치들을 절단합니다. 그 후 절단된 각 장치를 추가 처리를 위해 다시 페트리 접시에 넣습니다.

일반적으로 기기를 유체와 연결하기 위해 PDMS 기기에 구멍을 뚫습니다. 구멍을 뚫는 데 사용하는 기기는 표준 3mm 주사기입니다. 3mm 주사기의 끝에는 뭉툭한 팁의 스테인리스 스틸 니들이 달려 있습니다.

스테인리스 스틸 바늘 내부에는 바늘의 내경에 맞는 와이어가 들어 있습니다. 이 와이어는 시린지의 플런저에 연결되어 있습니다. 플런저를 뒤로 당겨 바늘을 후퇴시킴으로써 PDMS에 구멍을 뚫거나 플러그를 낼 수 있습니다. PDMS 장치를 뒤집은 후 플런저를 밀어내어 배출하십시오.

펀칭 장치를 사용할 때의 핵심은 플런저를 최대한 수직으로 유지하고 펀칭 장치를 전혀 회전시키지 않는 것입니다. PDMS를 펀칭한 후, 핀셋으로 PDMS 장치 전체를 들어 올려 뒤집은 다음, 플런저를 눌러 플러그를 배출합니다. 그 후 핀셋으로 플러그를 집어 폐기합니다.

그런 다음 플런저를 다시 당기고, 장치를 다시 아래로 뒤집은 후 커팅 장치를 꺼냅니다. 모든 구멍이 뚫릴 때까지 이 과정을 반복합니다. 본딩 공정의 경우, PDMS 장치를 유리 슬라이드에 본딩합니다.

저희 장치에서는 PDMS를 유리 슬라이드에 비가역적으로 결합하거나 공유 결합시키겠습니다. 이는 장치들을 플라즈마 애셔(plasma Asher)에 넣고 반응성 산소 플라즈마에 노출시켜 수행합니다. 이에 대한 단계는 PDMS 장치를 가져와 플라즈마 애셔의 트레이 위에 놓는 것입니다.

장치의 기능부가 위를 향하게 한 상태에서 모든 표준 유리 현미경 슬라이드를 사용할 수 있습니다. 본 연구에서는 장치에 맞게 약간 더 큰 1.5인치 현미경 슬라이드를 사용하였습니다. 제품 패키지에 들어있는 상태 그대로 사용 가능합니다.

우리는 피라냐 용액으로 이를 처리하는 것을 권장합니다. 이는 유리 슬라이드 표면에 있을 수 있는 유기 오염 물질을 제거합니다. 디바이스와 유리 슬라이드를 플라스마 애셔(plasma Asher)용 트레이 위에 놓은 후, 트레이를 플라스마 애셔 내부로 밀어 넣어 반응성 산소 플라스마에 노출시킵니다.

플라스마 Asher 프로그램이 완료되면 챔버를 열고 장치가 놓인 플레이트를 벤치탑으로 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 장치를 조심스럽게 들어 올리되, 손가락이 접합면에 닿지 않도록 주의합니다. 접합면이 유리 슬라이드 쪽을 향하도록 뒤집어 올린 후, PDMS와 유리 슬라이드 사이에 기포가 없는지 확인합니다.

유리에 본딩된 PDMS 장치를 핫플레이트 위에 올려 65 to 75 °C에서 10분 동안 가열하여 화학적 결합력을 높입니다. 이 섹션에서는 본딩 후 PDMS와 유리의 표면을 화학적으로 변형시키는 과정을 다룹니다. 클린룸에서의 본딩 단계 이후, 표면에는 반응성 OH 그룹이 존재하는 PDMS 표면이 남게 됩니다. 이러한 반응성 표면은 친수성 성질을 띠며, 시간이 지나면 점차 PDMS 내부로 확산되어 사라지게 됩니다.

표면 화학 처리는 플라스마 처리 직후에 수행하는 것이 가장 효과적이므로, 5% 3-mercaptopropyltrimethoxysilane 용액을 사용하겠습니다. 이는 부피 기준 5% 용액이며, 기본적으로 이 용액을 입구에 주입하여 기포 없이 장치 내부를 완전히 채워줍니다.

기포가 있는 경우, 핀셋으로 밀어내어 제거합니다. 슬라이딩 락(slan)을 주입한 후 15~30분 동안 그대로 둡니다. 일반적으로 상온에서 반응 시작 10분 후에 슬라이딩 락(slan)을 두 번째 분량만큼 추가로 주입합니다.

실란이 약 30분 동안 반응한 후, 순수 에탄올을 소자 부피의 3~4배만큼 흘려보내 모든 소자를 세척합니다. 배출되는 과잉 용액은 킴와이프(chem wipe)로 닦아냅니다. 소자를 헹군 후, 소자를 집어 100 °C로 설정된 핫플레이트 위에 올려두어 내부의 에탄올을 증발시킵니다. 이는 실란 표면을 어닐링(anneal)하는 데 도움이 됩니다.

장치가 건조되면 수개월 동안 데시케이터에 보관하거나, 장치를 가져와 즉시 다음 단계로 진행할 수 있습니다. 장치가 경화되면 유리와 PDMS 표면 모두에 실란 코팅이 형성됩니다. 여기서 사용된 실란은 티올 기를 포함하는 캡토실란(capto silane)이며, 이는 헤테로 이관능성 가교제인 GMBS와 반응하게 됩니다.

이 물질은 순수 에탄올에 희석되어 있습니다. 물과 반응하므로 수성 조건에 노출되지 않도록 주의해야 합니다. 장치에 이를 주입하고, 제가 지금 하는 것처럼 핀셋으로 기포를 제거하여 모든 표면이 이 분자와 결합하도록 합니다.

덮개를 덮고 30분 동안 반응시킵니다. GMBS가 30분 동안 반응한 후, 장치 내에 남아 있는 에탄올 흔적을 제거하기 위해 탈이온수로 장치를 세척합니다. 그런 다음 비오틴 결합 단백질인 NeutrAvidin을 흘려줍니다.

그 후 neutravain을 10 µg/mL 농도로 희석합니다. 기기 내부로 공기가 실수로 주입된 경우, 모든 공기를 효과적으로 제거하기 위해 에탄올로 기기를 다시 플러싱해야 합니다. 에탄올은 기기 표면을 더 잘 적셔주어 실수로 유입된 공기 방울을 제거할 수 있게 합니다. 이온수로 플러싱을 마친 후, 일반적으로 희석된 neutravain 용액을 기기 부피의 2~4배만큼 채웁니다.

Nutt travain은 Nutt travain의 임의의 1차 수단을 통해 표면에 고정된 GMBS와 반응합니다. 이 과정은 상온에서 1시간 동안 진행될 수 있습니다. 일반적으로, 저는 장치들을 4 °C의 저온실에 하룻밤 동안 둡니다.

하지만 항체를 추가하기 전에, 용액 내에 결합되지 않은 모든 Aden을 씻어내고자 합니다. 이를 위해 PBS에 희석된 1% BSA 용액을 흘려보냅니다. 이 칩들은 이후의 유전체 분석에 사용될 예정이므로, 사용하는 모든 용액은 RNA-free 상태여야 합니다.

일반적으로, 1% BSA 용액을 기기 부피의 4~5배만큼 흘려보내 세척합니다. 그 다음, 항체를 첨가합니다. 본 실험에 사용되는 항체는 전혈 내 과립구에 특이적인 CD 66 B입니다.

우리는 10에서 25 µg/mL 사이의 농도를 사용하며, 항체를 주입합니다. 각 장치에 200 µL의 항체를 주입합니다. 장치의 각 포트에 100 µL씩 두 번 주입합니다.

일반적으로, 한쪽 포트에 100 µL를 주입하고 30분 동안 기다린 후, 반대쪽 포트에 추가로 100 µL를 주입합니다.