Microfluidic 장치를 사용하여 셀 캡처

준비된 장치들은 10개 또는 20개 단위의 키트로 포장되어 있으며, 배송 시 박스에 담겨 냉장 상태로 전달됩니다. 키트에는 실험 수행에 필요한 모든 구성품이 포함되어 있습니다. 키트 내의 실험 구성품으로는 주사기와 완충액이 들어있는 패킷이 있으며, 이는 실온에서 보관 가능합니다. 또한, 본 실험에서 따를 프로토콜 사본이 함께 제공됩니다.

또한 냉장 상자가 있으며, 여기에는 실제 장치와 냉장이 필요한 모든 작동 버퍼가 들어 있습니다. 일반적으로 키트는 10개 또는 20개 단위로 포장되어 있습니다. 사용하지 않을 때는 키트를 냉장 보관해야 합니다.

각 주사기와 키트 구성품에는 세심하게 라벨이 부착되어 있으며, 이 라벨들은 우리가 따르는 프로토콜의 표와 일치합니다. 따라서 개별 단계에서 어떤 주사기나 키트 구성품을 사용해야 하는지에 대해 모호함이 없습니다. 장치들의 포장을 풀고 생물학적 안전 작업대(biological safety cabinet)에 배치한 후, 호중구를 분리하고 이후의 게놈 응용 분석을 위해 용해하는 절차를 수행하겠습니다. 이는 얻어진 세포 용해물을 사용하여 분리하거나, 세포 용해물에서 RNA를 추출할 예정이기 때문입니다.

따라서 실험 공간이 단순히 멸균된 상태일 뿐만 아니라, 일반적으로 환경에 존재하는 모든 RNA로부터 깨끗한 상태인지 확인해야 합니다. 그러므로 RNA를 분해하는 용액으로 모든 작업 구역과 장비를 닦아내는 것이 매우 중요합니다. 일반적으로 여러 제조사에서 구입할 수 있는 RNA SAP 또는 RNAs away를 사용하여 모든 도구와 작업 표면을 닦아냅니다.

장치는 열 밀봉 파우치에 포장되어 제공됩니다. 각 장치는 밀봉되어 있으며 바코드가 부착되어 있습니다. 임상 샘플을 사용하는 경우, 이 바코드를 기록해 두어야 합니다.

이제 장치의 밀봉을 해제하고 커버를 벗긴 후, 펌프 유지 매니폴드 장치(pump Holding manifold device)에 배치합니다. 사용할 혈액 샘플은 전혈 샘플입니다. 이를 표준 1 mL BD 주사기에 넣어 흘려보낼 것이며, 이 주사기를 주사기 1로 표시합니다.

일반적인 절차는 패키지에서 시린지를 꺼내고 혈액 튜브의 캡을 조심스럽게 제거하는 것입니다. 그다지 700 µL 또는 0.7 mL의 혈액을 취하여 그 중 절반인 350 µL를 1.5 mL 튜브에 주입합니다. 이렇게 하면 혈액을 추가 공정으로 전달할 수 있습니다.

혈액 샘플 튜브를 전달한 후에도 장치 결함이 발생할 경우를 대비해 여분의 혈액을 남겨둘 수 있습니다. 이제 혈액이 들어있는 주사기를 이 장치가 연결된 튜브의 바늘에 장착하겠습니다. 미세유체 분리 장치를 다룰 때는 매우 주의해야 합니다.

장치 내부에 기포가 유입되지 않도록 매우 주의해야 하며, 그렇지 않으면 장치가 제대로 작동하지 않을 수 있습니다. 따라서 일반적으로 주사기의 플런저를 눌러 장치의 상단 표면에 액체를 가하며, 모든 액체를 배출하기 전에 표면이 완전히 젖었는지 확인합니다. 그 다음 멈춘 뒤 주사기 몸체를 바늘에서 조심스럽게 분리하고, 주사기에 남아 있는 버퍼로 바늘 팁이나 바늘의 루어 커넥터를 채웁니다.

그것을 폐기합니다. 그런 다음 혈액이 든 주사기를 가져와 이 루어 허브(lure hub)에 삽입합니다. 이때 혈액을 쏟지 않도록 주의하고 공기 방울이 유입되지 않도록 주의하십시오.

혈액이 유출될 경우를 대비해 시린지의 본체와 튜브를 킴와이프스(Kimwipe)로 잡는 것이 좋습니다. 시린지를 튜브 하우징이나 바늘에 연결한 후, 커넥터 부분에 있을 수 있는 기포를 제거하기 위해 가볍게 여러 번 톡톡 쳐줍니다. 그런 다음 이 시린지를 시린지 펌프에 장착하고 고정 나사로 고정합니다.

주사기 펌프의 전원을 켭니다. 펌프에는 이미 유량 조건이 사전 설정되어 있습니다. 혈액을 30 µL/min의 속도로 장치에 흘려보낼 것입니다. 주사기 본체를 주사기 펌프에 장착한 후, 가동 플런저 암의 버튼을 눌러 플런저 상단에 닿을 때까지 아래로 밀어 내려 팁을 통해 액체가 배출되기 시작하도록 합니다.

이것은 끝이 뭉툭한 스테인리스 스틸 니들입니다. 시스템의 프라이밍이 완료된 것을 확인하면 실행 버튼을 누릅니다. 혈액의 흐름을 시작하려면 정지 버튼을 눌러 멈춘 다음, 깨끗한 1.5 mL 원심분리 튜브 또는 펜도르 튜브를 사용하여 조심스럽게 분리합니다.

하나만 분리하십시오. 장치의 포트 하나에서 튜브를 뽑습니다. 이 튜브가 분리되면, 이를 1.5 mil 펜도르 튜브에 삽입합니다. 그런 다음 run 버튼을 눌러 혈류를 다시 시작합니다.

혈액 방울이 형성되면 펌프를 멈추고, 장치에 막 열어둔 입구에 삽입합니다. 'Run' 버튼을 눌러 혈액을 흐르게 하고 5분 동안 타이머를 설정합니다. 혈액이 모든 챔버에 균일하게 채워졌는지, 그리고 장치 내에 뚜렷한 기포가 없는지 확인해야 합니다.

챔버로 들어가는 흐름을 방해하는 기포가 있는 경우, 핀셋을 사용하여 포획 챔버로 이어지는 작은 채널이나 포획 챔버에서 나가는 작은 채널을 따라 훑어줄 수 있습니다. 장치가 잘 채워지고 있으므로, 5분 후에 시린지 펌프의 정지 버튼을 눌러 혈액의 흐름을 멈추고, 시린지 클램프를 풀어 시린지 펌프 홀더에서 꺼냅니다. 그런 다음 nuclease free PBS가 충전된 3번 시린지를 사용하겠습니다. 기본적으로 기포 발생을 방지하기 위해 장치의 표면이 젖어 있는지 다시 한번 확인하고, 시린지를 가볍게 쳐서 모든 기포가 시린지 본체의 상단으로 모이게 합니다.

시린지 펌프의 암(arm)을 풀고 3mL 시린지를 펌프에 삽입합니다. 암을 조인 다음, 플런저가 시린지의 플런저와 닿을 때까지 아래로 누릅니다. 실행(run) 버튼을 누르고 액체가 장치 내에 충진될 때까지 기다리며, 스테인리스 스틸 바늘 끝에 액체 방울이 맺히는지 확인합니다.

방울이 형성되는 것이 보이면 펌프를 중단합니다. 혈액이 묻어 있는 스테인리스 스틸 팁을 제거합니다. 세척 버퍼를 삽입하고 run을 누릅니다.

이 상태로 5분 동안 가동합니다. 깨끗한 와이프를 사용하여 입구 또는 출구에 남아 있을 수 있는 소량의 혈액을 닦아내십시오. 장치에 세척 버퍼를 5분 동안 흘려보내면 혈액이 완전히 제거되며, 장치 내에 더 이상 붉은 혈액이 남아 있지 않고 투명하게 보이는 것을 확인할 수 있습니다. 5분이 지나면 세척 버퍼의 흐름을 중단합니다.

그리고 다시 시린지 펌프에서 시린지를 제거합니다. 유연한 배출 튜브 끝에 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브의 캡을 씌웁니다. 그런 다음 장치에서 폐액 튜브를 끌어내며 마이크로 원심분리 튜브를 조심스럽게 들어 올립니다.

이것은 바이오하자드 폐기물 용기에 버리겠습니다. 키트에는 테플론 재질의 새로운 배출 튜브가 들어 있으며, 여기에도 마찬가지로 스테인리스 스틸 팁이 달려 있습니다.

기존의 배출 튜브를 이 새로운 배출 튜브로 교체하겠습니다. 배출 튜브를 가져와 U자 또는 V자 모양으로 구부려 줍니다. 또한 키트에는 카야 쉬레더 컬럼(kaya shredder column)이 포함되어 있으며, 이는 DNA를 절단하고 기본적으로 세포 용해물을 균질화합니다.

이제 shredder 컬럼의 보라색 캡을 열고 배출 튜브를 Kay Shredder 컬럼에 넣겠습니다. 키트에서 RLT용이라고 표시된 2번 시린지를 꺼내 사용하겠습니다. 이는 22게이지 뭉툭한 팁의 스테인리스 스틸이 장착된 표준 BD 1 mL 시린지입니다.

이를 사용하여 기기에 350 µL의 Qiagen 표준 RLT를 주입하겠습니다. 기기에 약 50 µL의 dead volume이 있으므로, RLT를 주입하되 RLT 뒤에 공기 플러그를 함께 주입하여 기기의 dead volume에 있는 액체를 chi shredder 컬럼으로 밀어내고자 합니다. 이를 위해 시린지로 공기 350 µL를 먼저 뽑아낸 다음, 이어서 350 µL(0.35 mL)의 RLT를 뽑아내어 RLT가 시린지 바닥 쪽에 위치하도록 합니다.

주사기를 뒤집어 공기를 주입하고 싶은 유혹을 참으십시오. 이 공기는 RLT 용액이 Kay shredder 컬럼에 완전히 들어가도록 하기 위한 것입니다. 이제 세척 버퍼가 연결된 튜브를 제거하겠습니다.

RLT가 담긴 주사기를 삽입하고, 약 30초에 걸쳐 RLT를 장치에 천천히 주입하며, 이때 배출 튜브의 폐액이 chi shredder 컬럼으로 배출되는지 확인합니다. 장치 내부로 공기가 주입되기 시작하면, 플런저를 눌러 모든 액체가 Kay Shredder 컬럼으로 배출될 때까지 기다립니다. kay shredder 컬럼을 회수하여 밸런스를 맞춘 후, 벤치탑 마이크로 원심분리기를 사용하여 15,000 RPM 또는 최대 RPM으로 2분 동안 원심분리합니다.

컬럼을 2분 동안 원심분리한 후, 현재 RLT에 들어 있는 샘플을 꺼내 제공된 보라색 캡 크라이오 튜브(cryo vial) 중 하나에 옮깁니다. 임상 샘플을 사용하여 크라이오 튜브를 처리하는 경우, 실험 시작 단계에서 라벨을 부착하십시오. 여기 크라이오 튜브에 담긴 용해물(lysate)이 있습니다.

이 cryo vial을 즉시 -80 °C 냉동고에 넣어 운송 또는 추후 RNA 추출을 위해 보관합니다. 이것은 호중구 분리를 위한 대체 프로토콜입니다. RLT buffer로 세포를 용해하는 대신, 표준 조직학적 염색법으로 세포를 염색하겠습니다.

염색 과정입니다. 봉인된 장치를 봉투에서 꺼내 다시 포장을 풉니다. 장치에 기재된 로트 번호를 기록하고 페트리 접시를 페트리 접시 홀더에 놓습니다.

봉투에서 1 mL 주사기(주사기 1번)를 꺼내 700 µL의 혈액을 채운 다음, 그 중 절반인 350 µL를 endotainer DPH 튜브에 주입합니다. 이를 따로 둡니다. 이제 연결 튜브가 장착된 주사기 4번을 사용하여 장치 내로 혈액을 주입합니다.

튜브 끝부분의 바늘 하단을 화학적 방식으로 고정합니다. 시린지 몸체를 제거하고 루어를 채웁니다. 어댑터는 해당 시린지를 완충하고 폐기합니다.

화학 세정용 와이프(chem wipe)를 사용하여 흘러나오는 액체를 닦아내며, 혈액이 담긴 시린지를 바늘에 삽입합니다. 바늘과 시린지 본체 연결 부위에 있는 기포를 제거하기 위해 시린지를 가볍게 탭합니다. 시린지를 시린지 펌프에 장착한 후, 시린지 펌프의 이동 암(moving arm)을 눌러 튜브의 프라이밍(priming)을 수행합니다.

장치인 캡처 디바이스의 배출구 중 하나에서 튜브를 분리하여 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 넣습니다. 그런 다음 시린지 펌프의 run 버튼을 눌러 혈액을 흐르게 합니다. 스테인리스 스틸 팁에 혈액 방울이 맺힐 때까지 기다립니다.

혈액 방울이 형성되면 정지 버튼을 누르고 혈액을 닦아낸 뒤, 이를 장치에 삽입하고 실행 버튼을 누릅니다. 이제 5분 동안 타이머를 설정합니다. 장치를 통해 5분간 흐른 후, 시린지 펌프의 정지 버튼을 누르고 시린지를 분리합니다.

이제 해당 주사기를 1X PBS인 세척 버퍼가 들어 있는 3mL 주사기로 교체하겠습니다. 다시 한번 장치 상단이 밀폐되었는지 확인한 후, 혈액이나 플라즈마가 묻어 있는 바늘 팁을 제거합니다. 장치의 프라이밍을 시작하십시오.

액적 형태가 형성되면, 이를 장치에 삽입하고 실행(run) 버튼을 누릅니다. 입구 또는 출구 튜브에 묻은 혈액을 닦아내고, 세척 단계 이후 5분 동안 흐르게 둡니다. 다시 시린지 펌프를 멈추고 펌프 홀더에서 시린지를 제거합니다. 표준 GIM 염색을 위해, 먼저 100% methanol을 사용하여 세포를 고정하고 탈수시킵니다.

이제 methanol이 미리 충전된 3 mL 시린지가 준비되었습니다. 다시 한번 시린지를 프라이밍하여 methanol이 잘 흐르는지 확인한 후, 시린지 펌프를 멈추고 장치에 삽입한 다음 실행 버튼을 누릅니다. 이 methanol 용액에서 2~4분 동안 고정 과정을 진행하겠습니다.

고정과 메탄올 처리 후 2~4분이 지나면 펌프를 멈추고 메탄올이 담긴 시린지를 분리합니다. 그런 다음 Sigma 사의 Eosin stain 표준액을 탈이온수에 1:5로 희석하여 3 mL 시린지에 채웁니다. 희석된 용액을 시린지에 채운 후, 시린지 끝에 0.8 µm 필터를 부착하여 장치를 막을 수 있는 입자들을 걸러냅니다. 5~10분 동안 염색합니다.

그런 다음 탈이온수로 헹굽니다. 5~10분간 염색한 후, 시린지 펌프를 멈추고 염색 완충액이 든 시린지를 탈이온수가 든 시린지로 교체합니다. 기본적으로 장치에서 SAI의 푸른색이 씻겨 나가는 것이 보일 때까지 세척합니다. 장치에서 과잉의 gim sustain이 헹궈지면, 세척 용액의 주입을 중단합니다.

그 다음으로 입구에서 물 주입용 시린지를 제거하겠습니다. 이어서 장치의 출구 튜빙을 집어 핀셋으로 튜빙의 끝부분을 잡겠습니다.

이것은 유연한 tigon 튜브이며, 이를 장치의 입구에 다시 삽입할 것입니다. 이렇게 하면 장치가 밀폐되어 세포의 수분 상태가 유지되고 형태가 보존됩니다. 이제 제 동료인 John Hong Chang 박사가 CD4 양성 림프구의 분리를 위한 대체 프로토콜과 이어서 미세유체 장치 내에서 직접 수행하는 면역형광 염색 방법을 보여드리겠습니다.

제 이름은 Shong Hong이며, 오늘은 미세유체 장치 내에서의 세포 염색 방법을 시연하겠습니다. 앞선 단계에서 미세유체 면역 친화성 분리 장치를 사용하여 전혈에서 특정 혈구 세포를 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 과정의 목적은 세포를 용해하여 분리된 세포로부터 단백질과 DNA 함량을 얻는 것입니다. 제 연구의 경우에는 세포를 획득한 후 세포 수를 측정하는 것에 관심이 있으며, 예를 들어 전혈에서 CD4 세포 수를 측정하여 이를 진단 목적의 지표로 활용하고자 합니다.

따라서 사용하는 장치는 Ken의 장치와 매우 유사합니다. 이 장치는 PDMS 직선 챔버로 제작되었습니다. 기하학적 구조가 약간 다르기 때문에 작동 파라미터는 조금 차이가 있지만, 전반적인 작동 절차는 대체로 매우 유사합니다.

따라서 세포 포집 및 세척 단계는 모두 생략하고, 세포 계수 절차의 세포 염색 단계로 바로 넘어가도록 하겠습니다. 여기 전혈에서 세포가 이미 포집된 장치가 있으며, PBS로 세척이 완료된 상태입니다. 즉, 불필요한 세포들은 이미 장치 밖으로 씻겨 나갔으며, 장치 내에 분리된 세포들을 라벨링하는 데 사용되는 항체 혼합물을 미리 준비해 두었습니다.

여기서 사용한 항체 농도는 형광 현미경 하에서 세포를 매우 높은 형광 강도로 염색할 수 있도록 최적화되었습니다. 절차는 매우 간단합니다. 항체 용액이 채워진 주사기를 주사기 펌프에 장착한 후, 유속이 필요한 매개변수로 정확히 설정되었는지 확인합니다.

그런 다음 시린지 펌프를 작동시키고 튜브 끝을 확인하여, 튜브 내에 기포가 남지 않도록 용액이 완전히 나오는지 확인합니다. 그 후 세포가 포획되어 있는 미세유체 장치에 튜브를 연결합니다. 이제 항체가 장치 내부로 흐르며 장치 내에 분리된 세포들을 염색하게 됩니다. 여기에서의 유속은 5 µL/min을 사용하고 있으나, 장치의 기하학적 구조에 따라 목적에 맞는 서로 다른 유량 매개변수를 사용할 수 있습니다.

그리고 항체 용액을 5분 동안 흘려보낼 것인데, 이는 마이크로채널 내의 모든 용액을 교체하기에 충분한 양입니다. 항체 주입 후에는 흐름을 중단합니다. 즉, 마이크로채널 내의 모든 용액을 교체하기 위해 5 µL/min의 속도로 5분 동안 항체를 흘려보냅니다.

그 후 흐름을 멈추고 장치를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이때 형광 항체가 염색 항체와 함께 세포가 배양되는 동안 소광되는 것을 방지하기 위해 암실에서 진행해야 합니다. 보통 15분에서 30분 동안 염색한 후, 장치에서 튜브를 분리하고 항체 시린지를 버퍼 시린지로 교체하여 장치 내의 결합되지 않은 항체를 세척합니다.

여기서 세척 용액은 PBS 용액에 1% BSA가 포함되어 있습니다. BSA는 표면에서 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 사용하며, 동일한 과정을 진행하겠습니다. 먼저, 시린지 펌프의 유속을 조정하여 원하는 정확한 유속인지 확인한 다음, 시린지 펌프를 작동시켜 장치에 연결하기 전 튜브에서 실제로 액체가 나오는지 확인합니다.

그렇게 하는 목적은 튜브 내에 잔류 기포가 남지 않게 하기 위함입니다. 그래야 주입 시 기포가 장치 내부로 들어가지 않습니다. 이제 튜브를 장치에 연결하고 5분 동안 더 흘려주어, 장치 내의 모든 세척액과 결합하지 않은 항체를 모두 씻어냅니다.

세척 단계 이후, 1% PFA로 세포를 고정합니다. 이렇게 하는 목적은 이미징을 즉시 수행할 수 없는 경우, 장치를 최대 몇 주 동안 보관하기 위함입니다. 따라서 절차는 매우 간단합니다.

이전 과정과 유사합니다. 주사기를 펌프에 장착하고 유량을 원하는 값으로 조절한 다음, 주사기 펌프를 작동시켜 튜브를 장치에 연결합니다. 그런 다음 세포를 고정하기 위해 고정액인 paraform IDE 용액을 장치 내로 주입합니다. 다시 한번, 약 5분 동안 용액이 흐르도록 둡니다.

따라서 PFA는 장치 내의 모든 완충액을 대체하여 장치 안의 모든 세포를 고정합니다. PFA 고정 단계가 끝나면 PFA 주사기를 제거하며, 이제 장치는 이미징 준비가 완료된 상태가 됩니다. 경우에 따라, 세포 표면 마커 염색과 중첩하여 보여주기 위해 핵 염색을 수행하기도 합니다.

따라서 이를 위해 마지막 단계에서 DPI를 사용하여 핵 염색을 수행하겠습니다. DPI 시린지를 장착하고 시린지 펌프를 켜서 장치 내로 DPI를 흘려줍니다. 이렇게 하면 세포 내의 핵이 염색되어 세포의 위치를 확인할 수 있게 됩니다.

이 DPI 염색 이미지는 나중에 표면 마커 염색 이미지와 겹쳐서 세포의 위치를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 DPI 염색이 끝나면, 버퍼 용액을 사용하여 결합되지 않은 DPI를 다시 세척해야 합니다. 여기에서도 1% BSA가 포함된 PBS를 사용하여 결합되지 않은 DPI를 세척합니다.

작업 과정은 이전에 수행한 방식과 유사합니다. 버퍼 시린지를 장치에 연결하고, 버퍼를 장치 내부로 흘려보내 결합되지 않은 dap를 씻어냅니다. 이것으로 마이크로 유체 장치 내에서의 세포 염색 절차가 모두 완료됩니다.

모든 염색 과정이 완료되면 장치를 이미징할 준비가 된 것입니다. PFA 고정을 수행했으므로, 즉시 이미징을 진행할 수 없는 경우 장치를 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.