세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

제 이름은 Jiang이며, 하버드와 MIT의 보건, 과학 및 기술 분야 포스터 펠로우입니다. 저는 이 실험실에서 세포 행동을 연구하기 위한 새로운 마이크로 유체 장치를 제작하는 전문성을 가지고 있습니다. 저는 매우 새로운 기울기 장치를 제작할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 마이크로 유체 장치에 통합하여 제작할 수도 있습니다.

TC 장치는 세포-세포 상호작용 및 세포 간 상호작용뿐만 아니라 세포-외액 인자 접촉을 정밀하게 조절할 수 있습니다. 따라서 TC 시스템을 사용하여 기초 세포 생물학을 연구하고 이해할 수 있으며, 이를 발생 생물학 및 줄기세포 생체공학 분야에 적용할 수 있습니다. 제 이름은 Amir Manchi이며, 하버드-MIT 보건과학 및 기술 분과(Division of Health Sciences and Technology)의 Professor Haan 연구실 소속 학부생입니다.

저는 미세유체 장치를 연구해 왔으며, 미세유체 장치가 세포 배양 및 독성 연구와 같은 다양한 연구를 수행하는 데 매우 잠재력이 큰 장치임을 입증하는 개념 증명 작업을 진행해 왔습니다. 또한 유량, 기하학적 구조 및 기타 다양한 매개변수에 따른 이러한 장치 내부의 유체 특성을 연구하고 최적화하려고 시도했습니다. 현재 저희는 미세가공실에서 시작하고 있으며, 이제 미세유체 장치를 제작해 보고자 합니다. 미세유체 장치를 구현하기 위해서는 실리콘 웨이퍼 패턴과 그 위에 올릴 PDMS 몰드가 필요합니다. 이 PDMS 폴리머는 실제로 두 가지 서로 다른 물질의 혼합물입니다.

이는 실리콘 엘라스토머 베이스와 실리콘 엘라스토머 경화제의 혼합물입니다. 이 두 가지를 10:1 비율, 즉 베이스 10과 경화제 1의 비율로 혼합합니다. 이제 베이스 약 20 g을 준비하겠습니다.

경화제 2g도 필요하며, 경화제는 밀도가 훨씬 낮습니다. 훨씬 빠르게 나오므로 조금 주의해야 합니다. 현재 약 22이며, 이제 베이스와 경화제를 함께 혼합하겠습니다.

따라서 이를 위해 파이펫을 사용하겠습니다. 최대한 잘 섞이도록 충분히 혼합하겠습니다. 패턴이 형성된 실리콘 웨이퍼 위에 이 PDMS 폴리머를 부어줄 것이며, 실리콘 웨이퍼는 PDMS 몰드에 패턴을 형성하는 역할을 합니다.

여기 두 개의 실리콘 웨이퍼가 있는데, 하나는 미세 유체 장치의 상층용이고 다른 하나는 하층용이기 때문입니다. 미세 유체 장치 내부에는 채널을 형성해야 하며, 이 장치의 핵심은 해당 채널 내부로 유체를 흐르게 하는 것이므로 두 개의 층이 필요합니다. 현재 이 혼합물 내부에 기포가 많이 포함되어 있어, 두 실리콘 웨이퍼 위에 이 혼합물을 부어주어야 합니다.

이 기포들을 제거해야 하는데, 이를 위해 진공 상태를 이용합니다. 다시 메인 실험실 구역으로 돌아왔습니다. 앞서 말씀드린 것처럼 PDMS 혼합물 내부에는 많은 기포가 있으며 이를 제거해야 하므로, 진공 챔버 내부의 실리콘 웨이퍼 위에 혼합물을 놓겠습니다. 챔버를 닫고 진공 상태로 만들겠습니다. 이 과정이 끝나면 PDMS 몰드를 오븐에 넣고 하룻밤 동안 가열하여 더 단단하게 경화시키겠습니다.

이제 실험실에서 마이크로 유체 장치를 조립해 보겠습니다. 먼저 밤새 인큐베이터에 넣어 실리콘 웨이퍼 상의 패턴이 형성된 PDMS 몰드를 준비하겠습니다. 여기서는 두 가지 서로 다른 패턴을 사용할 것입니다. 왼쪽에 보이는 마이크로 채널이 상층부가 될 것이며, 오른쪽에 보이는 녹색 라인 패턴이 하층부가 될 것입니다.

이것이 마이크로 장치 내부의 홈을 형성하게 됩니다. 상단 층이 실리콘 웨이퍼에서 쉽게 분리될 수 있도록 이 겔들을 절단하는 것부터 시작합니다. 그런 다음 패턴이 위를 향하도록 하여 페트리 접시에 앞면이 위로 오게 옮기겠습니다.

초록색 선 패턴이었던 홈들에 대해서도 동일한 작업을 수행하겠습니다. 이것들이 바닥층을 형성하게 됩니다. 젤을 절단한 후 페트리 접시에 옮기고, 패턴 위에 먼지가 쌓이는 것을 방지하기 위해 테이프로 고정하겠습니다.

다음 단계는 세포와 배지가 드나들 수 있도록 채널의 양 끝에 구멍을 뚫는 것입니다. 표면이 넓어 패턴이 직접 보이지 않기 때문에, 채널을 확인하며 양 끝에 구멍을 뚫기 위해 이 도구를 사용하겠습니다. 한쪽 끝에는 여유 공간을 확보하기 위해 큰 펀치로 구멍을 뚫고, 반대쪽 끝에는 폴리에틸렌 튜빙을 연결할 수 있도록 작은 구멍을 뚫겠습니다.

현재 미세가공실에 있으며, 다음 단계는 준비된 두 가지 서로 다른 표면을 부착하는 것입니다. 이를 위해 플라스마 세척기(plasma cleaner)라고 불리는 장비를 사용하며, 이 공정을 플라스마 처리(plasma treatment)라고 합니다. 챔버 내부에서는 플라스마 환경이 조성되며, 플라스마와 표면의 상호작용을 통해 플라스마가 표면의 약한 결합을 끊고 이를 반응성이 매우 높은 화학기로 대체하게 됩니다.

이제 먼지 유입을 방지하기 위해 붙여두었던 테이프를 제거하고, 몰드들을 챔버 내부에 넣겠습니다. 문을 완전히 닫은 다음, 전원을 켜고 펌프를 작동시키면 준비가 완료됩니다. 5분에서 10분 후에 다시 확인하겠습니다.

이제 장치를 끄기 위해 펌프와 전원을 끄고 챔버를 엽니다. 현재 내부에 음압이 형성되어 있어 소리가 들릴 수 있습니다. 이는 음압 때문에 발생하는 현상이며, 이제 몰드를 천천히 꺼냅니다.

두 패턴 표면이 모두 위를 향하고 있으므로, 아래쪽 레이어를 왼손에 잡고 위쪽 레이어를 뒤집어 홈 위에 놓은 다음, 두 레이어를 서로 맞붙여 누릅니다. 이러한 플라즈마 처리기를 사용하면 접착 강도와 영구성을 확보할 수 있다는 장점이 있습니다. 현재 보시는 바와 같이, 위쪽 레이어의 채널과 아래쪽 레이어의 홈 패턴을 확인할 수 있으며, 이제 다음 단계로 진행할 준비가 되었습니다.

그런 다음 배양실로 이 배양액을 가져와 디쉬의 뚜껑을 엽니다. 이어서 피브로넥틴을 로딩하기 위해 피브로넥틴 60 µL를 취해 장치에 로딩합니다. 장치 내부에 흐름을 생성하여 채널 내부 벽면에 얇게 코팅되도록 하기 위해 배출구를 가볍게 흡입합니다.

그 후 이 장치를 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 둡니다. 인큐베이터 내부에서 1시간 동안 냉각시킨 후, 샘플을 인큐베이터에서 꺼냅니다. 그런 다음 3개의 파이버러스(fiber rust)를 사용하여 퓨전 및 디셰이드를 수행하고 배지를 넣은 후, 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

일반적으로 장치 내부에 약 100만 개의 세포를 배치합니다. 해리 과정이 끝난 후, 샴푸를 몇 번 밀어 넣어준 다음 세포 현탁액을 꺼내어 채널 내부에 로딩합니다. 채널 내부에 세포를 더 잘 로딩하기 위해 흡입기를 사용하여 부드럽게 흐름을 유도할 수 있습니다.

배지 잔여물과 표면 부유물은 배출구를 통해 일반적으로 자동으로 흡입되어 선택적인 글로벌 채널에 세포가 파종됩니다. 그 후 장치를 분리하여 인큐베이터에 1시간 동안 넣어두어, 세포가 채널 내부에 완전히 퍼질 때까지 기다립니다. 그런 다음 Annexin V와 propidium iodide, 그리고 hydrogen peroxide를 주입하면 됩니다.

그런 다음 시간 가설 분석을 수행합니다. 조직 배양 접시 내의 샘플을 채취한 후, 2 mL의 DMEM 배지와 20 µL의 Annex V, 40 µL의 propidium iodide, 100 mM의 hydrogen peroxide를 사용하여 용액을 조제합니다. 그리고 Annex V, propidium iodide, hydrogen peroxide가 포함된 2 mL의 배지를 취해 주사기에 넣습니다.

2 mL의 배지와 annex five prop iodide, hydro perside를 넣습니다. 용액을 실링 내부에 넣은 후 기포를 제거하고 C bear를 연결합니다. 이것은 가스 밀폐형 Hamilton warm mill 실링입니다.

이것은 3-베어(three bear)입니다. 이것은 일회용 천장 덮개입니다. 이것은 27 gauge 바늘입니다.

이것은 PE 20 폴리 튜빙입니다. 시린지에 용액을 채운 후, 완전히 밀어내기를 여러 번 반복하고, 때때로 시린지를 가볍게 쳐서 기포를 제거하며 용액을 다시 끌어당깁니다. 다시 한번 완전히 밀어내어 기포를 제거한 다음, 조심스럽게 다시 채웁니다.

이제 1회분 용액을 취한 다음 밸브를 전환합니다. 쓰리웨이 밸브를 통해 용액을 밀어내어 튜빙 내부를 완전히 채웁니다. 마지막으로 용액이 튜빙 끝으로 나오면, 튜빙을 마이크로 장치에 연결하고 분당 1 µL씩 주입하기 시작합니다.