'Peroxidative'와 '산화'히드록실 급진적 Footprinting에 의해 RNA 구조의 모니터링 평형 변경

다음 실험의 전반적인 목표는 하이드록실 라디칼 풋프린팅을 이용하여 RNA 분자가 어떻게 접히는지 확인하는 것입니다. 이는 RNA의 말단 표지, 겔 정제 및 사전 접힘 과정을 통해 수행되며, 이를 통해 후속 단계인 마그네슘 매개 접힘 전 RNA의 구조적 무결성을 보장합니다. 그 다음, 펜톤 시약을 혼합하여 하이드록실 라디칼을 생성하며, 이는 용매 접근성에 따라 RNA 골격을 절단할 수 있습니다. 이후, RNA 절단 생성물을 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리하고 자동 방사선 촬영법으로 시각화합니다.

밴드 적분 값은 반자동 풋프린팅 분석 소프트웨어를 통해 정량화됩니다. 최종 목표는 RNA의 3차 구조 형성을 반영하는 폴딩 등온선을 생성하는 것입니다. 이는 정규화된 밴드 적분 값을 분율 포화도로 스케일링함으로써 달성됩니다.

이후 등온 흡착선을 Hill 방정식에 맞추어 피팅할 수 있습니다. 하이드록시 풋프린팅의 주요 장점은 저렴한 화학 물질을 사용하여 RNA의 3차 구조 정보를 얻을 수 있다는 점입니다. 크기가 작은 하이드록시 라디칼은 활성이 더 높기 때문에 용매 접근 가능 뉴클레오타이드와 매몰된 뉴클레오타이드를 구분하는 완벽한 프로브가 됩니다. 이 방법은 RNA 구조 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 리보솜은 활성 구조에 도달하기 위해 금속 이온을 어떻게 활용할까요? 하이드록실 라디칼 풋프린팅은 RNA의 특이성과 인식의 기본 원리를 이해하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법은 RNA 3차 구조에 대한 정보를 밝혀낼 뿐만 아니라, RNA 또는 DNA 분자 내의 정밀한 단백질 결합 부위를 결정하는 데에도 사용될 수 있습니다.

이 방법의 주요 과제는 리보핵산분해효소(ribonuclease)에 의한 시료 분해를 방지하고, 적절한 양의 RNA 절단을 얻기 위해 철 농도를 최적화하는 것입니다. 또한, 밴드 간격의 세밀한 분석은 상당히 까다로울 수 있습니다. 이 비디오의 주된 이점은 시청자가 하이드록실 라디칼 풋프린팅(hydroxy radical footprint) 실험의 계획 단계와 성공적인 수행 과정을 이해하도록 돕는 것입니다. 이 프로토콜을 시작하기 전, 서면 프로토콜에 기술된 대로 모든 풋프린팅 시약을 준비하십시오.

이 비디오와 함께 제공되는 지침에 따라, 4개의 관련 DFOs를 사용하여 RNA를 생성하고 말단 표지할 수 있습니다. 변성 젤 전기영동을 사용하여 방사성 표지된 RNA를 정제하십시오. 0.3 molar sodium acetate를 사용하여 두 번의 연속적인 젤 추출을 통해 정제된 RNA를 회수하십시오.

그 다음, 수용액 0.5 milliliters를 에탄올 1 milliliter와 혼합하여 RNA를 침전시킵니다. 혼합물을 드라이아이스 위에서 1분 동안 배양합니다. 샘플을 원심분리한 후, 상층액을 제거합니다. 70% ethanol로 RNA 펠렛을 세척합니다.

추가 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠릿을 진공 상태에서 건조하십시오. 다음으로, 정제된 P 32 표지 RNA 샘플을 용해합니다. 1배 반응 버퍼 330 µL가 담긴 새로운 반응 튜브에 RNA 용액 30 µL를 피펫으로 분주하십시오.

에탄올로 RNA를 침전시킨 후 진공 상태에서 펠릿을 건조합니다. 건조가 완료되면, 서면 절차에 기술된 대로 이 펠릿을 사용하여 참조 래더를 생성할 수 있으며, 남은 완충 RNA 용액을 95 °C에서 2분 동안 가열하여 변성시킵니다. 샘플을 실온에서 15분 동안 방치한 후, 빠르게 원심 분리하여 응축물을 다시 용액으로 되돌립니다. 풋프린팅 실험을 시작하려면, 30웰 전기영동 겔을 채울 수 있는 충분한 샘플 양에 맞춰 27개의 반응 튜브를 준비합니다.

래더와 절단 대조군을 포함시킨 후, 적정 중간 지점의 조제물을 중심으로 여러 자릿수의 로그 스케일 상에서 균등한 간격이 되도록 최종 마그네슘 이온 농도를 결정하십시오. 1배 반응 버퍼 내 마그네슘 이온의 조제 방법은 텍스트에 별도로 기술되어 있습니다. RNA와 마그네슘 이온 용액을 50 °C에서 5분 동안 인큐베이션하십시오. 그런 다음 RNA 용액 10 µL를 해당 농도의 마그네슘 이온 용액 90 µL와 혼합하십시오.

최종 부피 100 µL가 되도록 각 혼합물을 50 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, RNA 폴딩이 일어나는 동안 용액이 25 °C에서 1시간 동안 평형을 이루도록 둡니다. 이와 동시에, 하이드록실 라디칼 풋프린팅 반응을 시작하기 직전에 서면 프로토콜에 설명된 대로 대조군 반응 혼합물을 준비합니다.

RNA 솔루션이 들어 있는 반응 튜브의 상단 내벽에 iron EDTA, sodium ascorbate, hydrogen peroxide를 각각 2 µL씩 서로 닿지 않게 분주하여 과산화 반응을 준비합니다. 격렬하게 혼합하여 풋프린팅 반응을 시작합니다. 15초 후, 순수한 차가운 에탄올 300 µL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다.

튜브를 3~5회 뒤집어 섞어줍니다. 마지막으로 앞서 수행한 것과 같이 펠릿을 침전, 세척 및 건조합니다. 과산화 반응의 대안으로, 갓 조제한 Fenton 반응 혼합물 5 µL를 샘플에 첨가하여 산화 하이드록실 반응을 수행할 수 있습니다. 산화 반응을 25 °C에서 30분 동안 배양합니다.

그 다음, 반응을 정지시키기 위해 차가운 순수 에탄올 300 µL를 첨가하고 튜브를 돌려 섞어줍니다. 다시 한번 침전시킵니다. 퍼옥시데이트(per oxidative) 또는 옥시데이트(oxidative) 반응이 완료되면 펠릿을 세척하고 건조합니다.

건조된 RNA 펠릿을 8 µL의 gel loading dye two에 녹입니다. 가이거 계수기를 사용하여 P 32 표지 RNA가 재현탁되었는지 확인합니다. 표준 프로토콜에 따라 8% 변성 폴리아크릴아마이드 시퀀싱 겔을 준비합니다. 30웰 콤을 사용하여 두 개의 레퍼런스와 절단 대조군을 포함한 샘플을 로딩합니다.

60~75W에서 2시간 30분 동안 RNA 단편을 분리합니다. 건조된 젤을 보관용 인광 스크린에 하룻밤 동안 노출시킵니다. 필름 없는 자동 방사선 사진 촬영을 위해 이미징 시스템으로 인광 스크린을 스캔합니다.

그런 다음 분석을 위해 겔 이미지 파일을 컴퓨터로 전송합니다. 데이터 분석을 시작하려면 단일 밴드 피팅 및 정량을 위한 오픈 소스 소프트웨어인 Safa를 실행합니다. RNA 서열을 .txt 파일로 불러온 후, 겔 사진을 .gel 파일로 불러옵니다.

레인을 정의하고 밴드 강도를 조정하십시오. 그다음 앵커 레인을 선택하고, RNA T one digestion ladder를 기준으로 밴드와 뉴클레오타이드를 매칭하는 젤 정렬 할당을 수행하십시오. 밴드 강도를 정량화하고 정규화/컬러 플롯 기능을 사용하여 정규화를 진행하며, 잠재적인 불변 잔기를 할당하십시오.

결과물을 txt 파일로 저장하십시오. SFA는 겔의 레인을 나타내는 열과 RNA 단편에 해당하는 개별 밴드 적분값을 나타내는 행으로 구성된 스프레드시트를 출력합니다. 먼저, 마그네슘 이온이 없는 샘플에서 얻은 보호 프로파일을 최종 마그네슘 이온 농도의 프로파일과 비교하여 용매 접근성에 뚜렷한 변화를 보이는 보호 부위를 식별해야 합니다.

값이 낮을수록 뉴클레오타이드가 하이드록실 라디칼의 공격으로부터 더 잘 보호됨을 의미하며, 그 반대도 마찬가지입니다. 다음으로, 스프레드시트 형식을 사용하여 마그네슘 철 농도에 따른 개별 또는 뉴클레오타이드 그룹의 밴드 강도 전이 곡선을 생성하십시오. 본 프로토콜의 텍스트 부분에 설명된 대로, 이러한 전이 값들을 분율 포화 함수에 맞게 개별적으로 스케일링하십시오. 마지막 단계로, 데이터를 Hill 방정식에 맞게 피팅하십시오.

본 분석은 전이를 분율 포화도로 환산하여 전이 중간점을 결정하며, 전이가 시그모이드 형태를 띠는지에 대한 현상학적 검증을 제공합니다. 다음은 P four P six RRNA 하이드록실 라디칼 풋프린팅 실험의 대표적인 결과입니다. 등온선은 Safa가 분석한 시퀀싱 젤로부터 도출되었으며, 분석 섹션에 기술된 방식대로 피팅되었습니다.

젤 이미지는 배경 분해가 최소화되었으며, T 1 레인에서 밴드가 뚜렷하게 나타나 단일 뉴클레오타이드 지정이 가능함을 보여줍니다. 하이드록실 라디칼에 의한 RNA 단편화는 배경 수준보다 훨씬 높게 나타납니다. 저농도에서 고농도 마그네슘 이온으로의 전이는 개별 밴드 및 밴드 그룹의 강도 감소와 선택적으로 연관되어 있으며, 이는 RNA의 형성을 나타냅니다.

3차 구조 보호는 절단 시 밴드 강도가 동시에 변화하는 단일 또는 연속된 뉴클레오타이드 그룹을 의미하며, 이는 saffer 분석을 통해 정량화 및 정규화됩니다. 결과물은 하이드록실 라디칼에 대한 보호 정도를 시각화한 열 지도(thermal plot)로 나타납니다. 색상 변화는 마그네슘-철 첨가에 따른 접근성 변화를 설명하며, 흰색에서 빨간색으로의 변화는 접근성이 더 높아진 뉴클레오타이드를, 흰색에서 파란색으로의 변화는 보호 정도가 더 높아진 뉴클레오타이드를 나타냅니다.

각 음영 단계는 수치 값과 연결되어 있으며, 이를 보호 곡선으로 도식화하고 Hill 방정식과 같은 결합 모델을 통해 분석할 수 있습니다. 본 예시에서 protection 1 5 3부터 1 5 5까지 연결된 평형 해리 상수는 protection 1 6 3부터 1 6 4까지의 해당 값보다 대략 두 배 정도 높습니다. 이 하이드록실 라디칼 풋프린팅 실험은 적절하게 수행될 경우 1.5일 만에 완료할 수 있습니다.

이 실험 절차를 수행할 때, RNA 오염을 방지하기 위해 반드시 장갑과 실험복을 착용해야 함을 유념하십시오. 또한, 최종 철 농도는 실험 시스템에 따라 달라집니다. 따라서 본 절차에 따른 풋프린팅(footprinting)을 수행하기 전에 용량 반응 실험(dose response experiment)을 실시하는 것을 권장합니다.

추가적인 질문에 답하기 위해 시간 분해 하이드록실 라디칼 풋프린팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, RNA 분자가 발달 후 어느 결정적인 시점에 미스폴딩되거나 활성 구조에 도달하는가 하는 점입니다. 이 기술은 구조 생물학 분야의 연구자들이 핵산의 중간 및 일시적인 분자 3차 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 RNA 분자의 3차 구조 형성을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 주의 사항으로, 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 보호 안경을 착용하고 플렉시글라스 차폐막을 사용하는 등의 위험 예방 조치가 권장됨을 잊지 마십시오.