혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

이 절차의 전반적인 목표는 기존 방법보다 짧은 시간 내에 혈액 배양 분리균의 항생제 감수성을 확인하고 평가하는 것입니다. 이는 먼저 새로운 16 s ribosomal DNA MultiPro PCR 분석법을 사용하여 혈액 배양 분리균을 확인함으로써 달성됩니다.

그 후 분리균을 항생제 패널과 함께 6시간 동안 배양합니다. 다음 단계는 정량적 16 s ribosomal D-N-A-P-C-R 분석법을 사용하여 항생제 존재 하에서 분리균의 증식 또는 증식 억제 여부를 결정하는 것입니다. 최종적으로, 결과는 이러한 배양과 PCR의 조합을 통해 혈액 배양 분리균의 동정 및 항생제 감수성 테스트를 더 빠르게 수행할 수 있음을 보여줍니다.

자동화된 phoenix 또는 IIC 시스템을 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 사전 배양 상태가 필요 없으며, 동정 및 항생제 감수성 테스트 결과를 당일에 확인할 수 있다는 점입니다. 해당 절차의 시연은 저희 실험실의 Vandy Hanson과 GID ing 박사 과정 학생들이 진행하겠습니다. 미생물 성장이 확인된 혈액 배양액 100 µL를 0.9% sodium chloride 900 µL가 들어 있는 반응 튜브에 희석하십시오. 그런 다음 샘플을 13,400 ×g에서 5분 동안 원심 분리하여 박테리아를 펠릿화하십시오.

Reese, 펠렛을 100 µL의 멸균 탈이온수에 현탁하십시오. 샘플을 4 °C에서 보관하며 추후 사용할 때까지 유지하십시오. 모든 샘플이 준비되면, 표적 박테리아로부터 특정 16 s 리보솜 DNA를 증폭시키기 위한 실시간 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오.

탈이온수를 사용하여 반응당 부피를 20 µL로 맞춥니다. 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 PCR 믹스 20 µL씩 분주합니다. 그다음 각 웰에 샘플 5 µL를 첨가하고 PCR 플레이트를 밀봉합니다.

다음으로, BI Prism 7, 900 HT 실시간 PCR 시스템에서 PCR을 수행합니다. PCR이 완료되면 먼저 분석 설정 탭을 사용하여 CT 분석 값을 0.1로 조정합니다. 그런 다음 베이스라인 설정을 시작 사이클 6, 종료 사이클 15로 좁힙니다. 각 샘플의 CT 값을 기록합니다.

PCR 결과를 양성으로 간주하기 위한 컷오프 값은 일반적으로 CT 값 35로 설정할 수 있습니다. 이 예시에서는 E. coli에 감염된 혈액 배양액의 식별 프로필이 두 가지 반응 믹스에서 나타납니다. Universal 16s ribosomal DNA 프라이머가 포함되었으며, CT 25.2와 25.95의 두 가지 증폭 곡선이 생성되었습니다.

세 번째 증폭 곡선은 Coli 특이적 프로브로부터 유도된 것입니다. 다른 특이적 프로브에서는 검출 가능한 신호가 생성되지 않았습니다. 병원균이 확인되면 항생제 테스트를 수행할 수 있습니다.

먼저 혈액 배양 양성 검체에서 5 mL의 배지를 혈청 분리관으로 옮깁니다. 샘플을 2000 ×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 튜브에서 상층액을 제거합니다. 그다음 멸균 면봉을 사용하여 튜브의 겔 층에 있는 박테리아를 0.9% sodium chloride에 옮겨 0.5 McFarland 표준의 탁도를 가진 용액이 될 때까지 희석합니다.

이는 밀리리터당 약 1.5 × 10⁸ CFU(colony forming units)에 해당합니다. 다음으로, 현탁액을 2배 농도의 Muller Hinton broth로 희석하여 약 5 × 10⁵ CFU/mL의 농도로 만듭니다.

항생제가 웰당 50 µL씩 분주되어 있는 마이크로타이터 플레이트에 현탁액을 웰당 50 µL씩 분주합니다. 항생제 대신 증류수를 넣은 웰을 사용하여 각 시료에 대한 양성 성장 대조군을 반드시 포함하십시오. 분주가 끝나면 플레이트를 덮습니다.

그런 다음, 박테리아가 성장할 수 있도록 플레이트를 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 음성 성장 대조군으로 사용할 박테리아 현탁액의 일부를 4 °C에 보관하십시오. 6시간 배양 후, 각 웰의 내용물과 음성 대조군 샘플을 각각 별도의 멸균 튜브로 옮깁니다.

16,000 ×g에서 5분간 원심분리한 후, 상층액 80 µL를 제거하고 펠렛을 멸균 탈이온수 80 µL에 재부유시킵니다. 16s ribosomal DNA 실시간 PCR에 사용하기 전, 시료를 물로 1:10 비율로 희석하십시오.

IQ cyber green super mix와 16 s ribosomal DNA 프라이머를 사용하여 PCR 믹스를 준비하고, 96웰 PCR 플레이트의 웰당 20 µL씩 분주합니다. 그런 다음 각 샘플 5 µL를 웰에 첨가하고 플레이트를 밀봉합니다.

다음으로, 결과를 분석하기 위해 PCR을 수행합니다. 먼저, 컷오프 CT 값을 계산합니다. 일반적으로 컷오프 CT는 양성 성장 대조군의 CT 값에 음성 성장 대조군 CT 값의 0.5배를 더한 후, 성장 대조군의 CT 값을 뺀 값과 같습니다.

하지만 그람 음성 간균의 piperacillin/tazobactam 및 CEF dazadi, 그리고 staphylococcus aureus의 amoxicillin, oxacillin, trimethoprim/sulfamethoxazole 또는 enterococcus SPP의 amoxicillin의 경우에는 증폭 인자를 0.5에서 0.25로 낮추어야 합니다. 각 시료 내 균주의 감수성 또는 내성은 시료의 CT 값을 컷오프 ct와 비교하여 결정할 수 있습니다.

컷오프 값보다 높은 CT 값은 감수성을 나타내며, 컷오프 값보다 낮은 CT 값은 내성을 나타냅니다. 다음은 항생제 감수성 증폭 곡선의 예시입니다. 앞서 확인된 E. coli 균주를 대상으로 각각의 곡선으로 표시된 여러 항생제에 대한 감수성 테스트를 수행하였습니다.

CT 값이 낮은 샘플은 항생제가 존재하는 환경에서도 성장이 일어난 샘플로, 테스트한 항생제에 대해 내성이 있음을 나타냅니다. 반대로, CT 값이 높다는 것은 성장이 일어나지 않은 샘플임을 의미하며, 이는 테스트한 항생제에 민감함(susceptibility)을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 9시간 이내에 완료할 수 있습니다.