인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

본 절차의 전반적인 목표는 감염된 마우스의 기도 내 인플루엔자 바이러스 역가를 효율적으로 정량화하는 것입니다. 마우스는 먼저 선택된 감염 후 시점에 인플루엔자 바이러스를 비강 내로 접종받습니다.

마우스를 희생시키고 기관지폐포 세척액(BAL fluid)을 수집합니다. 다음으로, 수집한 BAL fluid를 사용하여 MDCK 세포를 감염시킵니다. 감염된 세포는 특정 1차 항체와 이어서 적외선 접합 2차 항체를 사용하여 바이러스 단백질의 존재 여부를 염색할 수 있습니다.

적외선 신호는 Lycor Odyssey 스캐너를 사용하여 읽으며, Odyssey 소프트웨어를 사용하여 바이러스 역가를 결정할 수 있습니다. 표준 곡선을 이용하면 바이러스 역가의 정량적 결정이 가능합니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 바이러스 역가의 정밀한 정량화, 재현성, 그리고 분석 수행에 필요한 시료 부피가 적다는 점입니다.

이 기술의 시사점은 이 절차 이후 임상 시료 내의 바이러스 역가를 정량화하는 데 사용할 수 있으므로, 다양한 호흡기 바이러스 질환의 진단 및 치료로 확장될 수 있습니다. 바이러스 복제 수와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 QPCR과 같은 다른 방법이 수행될 수 있습니다. 이 기술을 시도할 때, 이러한 전개 이후 역가 표준 대조 바이러스를 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술은 바이러스 논리 분야의 연구자가 임상 샘플에서 바이러스 역가를 탐색하거나 바이러스 단백질의 트위스트 염색을 수행할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 기술을 숙달하면 17시간 이내에 수행할 수 있습니다. 정확한 수행 방법은 다음과 같습니다. 우선, 멸균 PBS 30 µL에 희석된 5,000 PFU의 PR eight 인플루엔자 바이러스를 마우스의 비강 내로 감염시키거나, 대조군으로서 PBS만을 투여합니다. 안락사시킨 동물로부터 BAL 액을 수집하기 위해, 먼저 가슴강을 절개하고 미세 멸균 가위로 기관과 평행하게 1 cm 절개하여 기관을 노출시킵니다.

기관에 작은 절개를 내고 1% BSA가 포함된 PBS 0.5 milliliters를 주입한 후, 세척액을 부드럽게 흡인합니다. 세척액 내의 바이러스 역가를 정량하기 위해 BAL 액체를 -20 °C에서 보관하십시오. 먼저 5 million 개의 MDCK 세포를 T 75 플라스크 내 20 milliliters의 완전 RPMI 배지에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양한 뒤, 다음 날 세포를 수확하여 광학용 평저 검정 96 웰 플레이트에 웰당 10,000 cells의 밀도로 분주합니다.

배양 후 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, FBS 대신 0.2% BSA가 포함된 혈청이 없는 완전 DMEM으로 세포를 두 번 세척합니다. 세포 세척이 완료되면, 웰당 50 µL의 BAL 액체 또는 기지의 농도로 포함된 바이러스 현탁액 50 µL를 첨가합니다.

그 다음, 바이러스의 부착, 진입 및 복제를 촉진하기 위해 0.2 µg/mL의 TPCK 처리 trypsin이 포함된 DMEM 배지를 웰당 50 µL씩 첨가합니다. 바이러스가 흡수될 수 있도록 세포를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 각 웰에 complete RPMI가 포함된 FBS 100 µL를 첨가하고 세포를 하룻밤 동안 배양하여 감염이 확산되도록 합니다.

1% B-S-A-P-B-S 100 µL로 세포를 세척합니다. 세포 세척이 끝나면, 웰당 1% paraformaldehyde 100 µL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 다음으로 웰당 1% B-S-A-P-B-S 100 µL로 세척하고, 블로킹을 위해 세포를 30분 동안 추가로 배양합니다. 블로킹이 완료되면, 1:1000으로 희석한 1차 항바이러스 M2 항체 50 µL를 웰당 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하여 존재하는 바이러스 단백질을 염색합니다. 배양 후, 1% B-S-A-P-B-S로 세포를 3회 세척하고, 1:200으로 희석한 적외선 염료 접합 2차 항체 100 µL를 웰당 첨가하여 암실 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 염색이 완료되면, 이전과 동일하게 3회 세척합니다.

그런 다음 플레이트를 Licor Odyssey 적외선 스캐너의 리딩 글라스 플랫폼 위에 배치합니다. Licor Odyssey 소프트웨어를 사용하여 리더기에서 96웰 플레이트 설정을 선택합니다. 블랭크 음성 대조군 웰을 지정한 후, 플레이트 전체의 형광을 정량화합니다.

자동 도형 도구를 사용하여 테스트 웰 중앙에 관심 영역(ROI)을 그립니다. 분석의 기저 형광값을 설정하기 위해 음성 대조군 웰의 ROI를 사용하며, Odyssey 소프트웨어에서 제공하는 두 개의 대립하는 십자선을 ROI 내에 배치하여 웰 전체의 형광 강도를 측정합니다.

다음으로, 검출을 위해 780 nanometer 채널을 사용하고 680 nanometer를 참조 파장으로 설정하여 플레이트를 스캔합니다. 읽기 명령이 활성화되면, ROI의 균일한 간격으로 형광 강도가 측정됩니다. 그 후 수집된 데이터 포인트들이 통합됩니다.

표준 편차 배수는 ROI에 포함될 기저선 대비 신호 수준을 결정합니다. 크기와 관계없이 정의된 영역의 순 픽셀 부피를 나타내는 통합 강도(integrated intensity) 옵션을 선택하여 계산하시기 바랍니다. 배경 형광은 모의 감염 대조군으로부터 정량화하며, 이를 통해 테스트 웰의 통합 강도를 추정합니다. 희석 배수별로 정량된 바이러스가 포함된 중복 웰의 적외선 형광을 사용하여 표준 곡선을 작성합니다.

표준 곡선을 사용하여 감염된 마우스의 BAL 액 내 역가를 결정할 수 있습니다. 본 실험에서는 2일 차와 4일 차에 바이러스 부하가 유의미하게 증가하는 것이 관찰되었습니다. 여기에 나타난 바와 같이, 감염 후 10일 차까지 바이러스가 제거되었습니다.

이 분석법을 사용하여 측정한 바이러스 역가는 감염 후 마우스의 체중 감소와 잘 상관됩니다. 이 기술은 인간 시료에도 적용할 수 있습니다. 여기에는 인간 비강 면봉에서 채취한 H1N1 바이러스의 정량 결과가 나타나 있습니다.

여기서 검출 한계는 10³ TCID 또는 조직 배양 감염량입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 적외선 염료 기반 분석법을 사용하여 인플루엔자 바이러스 역가를 추정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. Core imager 사용이 어려울 수 있으므로 이 기술에 대한 시각적 시연이 매우 중요하며, 이는 96 또는 384 웰 플레이트에서 바이러스 역가를 정량화하는 당사의 방법을 단순화하고 입증하는 데 도움이 될 것입니다.

마지막으로, 바이러스를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 개인 보호 장구와 같은 사전 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.