의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜

본 절차는 임상 또는 실험실의 Plasmodium falciparum 분리주를 사용하여 혈소판 매개 응집 분석을 수행하기 위한 표준화된 가이드라인을 제공합니다. 먼저, 감염된 환자로부터 혈액을 채취하고 원심분리를 통해 기생충에 감염된 적혈구를 수확한 다음, 무성 성숙 단계를 배양 및 정제합니다. 다음으로, 건강한 공여자의 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma)을 준비하고 표준화합니다.

응집 분석을 위해 혈소판과 기생충에 감염된 적혈구를 모두 혼합합니다. 면역형광 현미경 결과는 혈소판에 의해 매개된 P. falciparum 응집체를 보여줄 수 있습니다. 이 기술은 특히 Plasmodium species의 응집 표현형을 측정하기 위해 설계되었습니다.

자원이 부족한 환경에서의 임상 분리주. 현장 실험에서 응집 산(clumping acid)의 결과에 영향을 미치는 요인으로 절차상의 최소한의 변동이 보고된 바 있다. 따라서 말라리아 풍토병 지역의 현장 사이트 전반에 걸쳐 표준화를 이룰 수 있도록, 저자원 환경에 맞게 조정된 명확하고 따라 하기 쉬운 프로토콜이 필요했다. 소듐 시트레이트 바큐테이너에 말라리아 비감염 숙주로부터 약 5 mL의 전혈을 채취하거나, CM 또는 SM 말라리아 환자로부터 2.5 mL의 혈액을 채취한다.

전혈을 실온에서 250 Gs로 10분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 뿌연 상층액을 깨끗한 15 milliliter 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 혈소판은 온도 변화와 물리적 충격에 의해 쉽게 활성화될 수 있음을 유의하십시오.

Hemocytometer를 사용하여 PRP 현탁액의 세포 수를 측정하고, PBS로 조정하여 원하는 농도로 맞춥니다. PRP 분획의 일부를 1500 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 대부분의 혈소판을 제거함으로써 혈소판 결핍 혈장(PPP) 펠릿을 얻습니다. PRP 및 PPP 분획은 4 °C에서 최대 8~10일 동안 보관하십시오. 응집 분석에는 가급적 신선한 혈소판을 사용하는 것이 이상적입니다.

배양 플라스크에서 펠렛화된 말초 적혈구를 5~10 mL의 RPMI 1640으로 3회 세척합니다. 표준 말라리아 배양 배지와 감염되지 않은 신선한 적혈구를 PRBC에 보충하여 헤마토크릿 5%를 맞춥니다. 배양 플라스크를 92.5% 질소, 2.5% 산소, 5% 이산화탄소 혼합 가스로 충전합니다. 그 후 밀봉하여 환자 pbcs로부터 성숙한 기생충을 배양합니다.

배양 플라스크를 37 °C 인큐베이터에서 5% carbon dioxide 농도로 24~36시간 동안 배양합니다. 평평한 표면에 놓인 프로스티드 글라스 슬라이드의 한쪽 끝에 혈액 약 10~15 µL를 떨어뜨립니다. 두 번째 슬라이드를 45도 각도로 유지한 상태에서, 혈액 방울에 두 번째 슬라이드의 가장자리를 접촉시켜 혈액이 슬라이드 가장자리를 따라 고르게 퍼지도록 합니다.

첫 번째 슬라이드에 너무 많은 압력을 가하지 않으면서 빠르고 부드럽게 혈액을 고르게 도포합니다. 그런 다음 혈액의 얇은 막을 공기 중에서 건조시키고, 메탄올로 시료 부위를 10초 동안 탈수합니다. 이어서 다시 공기 중에서 건조시킨 후, 시료를 2% keem에 침지합니다.

최소 10분 동안 유지하십시오. 물이 맑게 나올 때까지 충분히 헹군 후 공기 중에서 건조시킵니다. 광학 현미경의 100 x 오일 침강 렌즈로 샘플을 관찰하십시오.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 성숙한 PFS parum, PRBC를 정제하고 동기화합니다. 배양물을 깨끗하고 멸균된 15 milliliter 튜브로 모두 옮깁니다. 상온에서 370 GS로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.

이제 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음, 전체 부피의 절반은 jello fusing으로, 나머지 절반의 3분의 1은 단백질 제거 배지로, 나머지 절반의 3분의 2는 pbcs로 구성하여 세포를 재부유시킵니다.

현탁액을 멸균된 15 milliliter 튜브로 옮기고, 상층과 하층 사이에 명확한 경계가 형성될 때까지 37 degrees Celsius 인큐베이터에서 15~20분 동안 배양합니다. 상층액을 조심스럽게 새 멸균 15 milliliter 튜브로 옮긴 후, 신선한 RPMI 10 milliliters를 첨가하고 370 to 430 GS에서 5분간 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

이제 앞서 설명한 대로 박막 혈액 도말법으로 기생충 및 발달 단계를 평가하고 광학 현미경으로 관찰하십시오. 혈장 겔 부상법을 통해 얻은 P RBC 현탁액을 새 1.5 milliliter 튜브에 담아 microliter당 1 × 10⁸ P RBCs가 되도록 조정합니다. P RBC를 5% hematocrit, 최종 농도 20 µg/mL의 acridine orange 또는 ethidium bromide, 그리고 전체 부피의 10% PRP에 현탁합니다.

마찬가지로, PBC 응집에서 혈소판의 역할을 확인하기 위해 감염되지 않은 적혈구와 PRP, 그리고 PPP를 포함한 PRBC 등의 대조군을 준비합니다. 이제 현탁액을 2 mL 스크류 캡 바이알로 옮깁니다. 바이알을 실온에서 10~12 RRP로 롤링하여 부드럽게 교반하며, 응집 형성 여부를 확인하기 위해 총 120분 동안 15~20분 간격으로 샘플링합니다.

샘플 10 µL를 슬라이드 글라스 위에 피펫으로 분주하고 커버 글라스로 덮어 형광 현미경으로 관찰합니다. 3개 이상의 감염된 적혈구가 모여 있는 경우를 응집체로 간주합니다. 본 실험에서는 plasma gel 부유법으로 농축한 후 p FALs 파라사이트의 성숙 단계 중 약 70%를 분석하였습니다. 응집체는 일반 광학 현미경으로도 쉽게 식별할 수 있으며, 세포 응집체의 형태로 나타납니다. 형광 현미경 하에서는 녹색 또는 적색 점으로 관찰됩니다.

각각 acridine orange 및 ethidium bromide 염색 시, 120분간 배양 후 덩어리 크기가 평균 덩어리당 15개 이상의 pbc로 유의하게 증가하며, 일부 덩어리는 시각적으로 계수할 수 없을 만큼 수많은 pbc를 포함하고 있습니다. 응집 표현형의 빈도는 중복 실험에서 계수된 감염 세포 1000개당 덩어리 내에 존재하는 감염 세포의 수로 계산합니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 Plasmodium falciparum의 혈소판 매개 응집 분석법을 수행하는 방법에 대해 명확히 이해하게 되었을 것입니다. 급격한 움직임이나 온도 변화로 인해 혈소판이 활성화되지 않도록 주의하십시오. 이 분석법은 중증 말라리아의 혈소판 매개 응집 분석을 측정하는 데에도 적용할 수 있습니다.