에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans

이 실험 절차의 전반적인 목표는 CL gans의 축삭 재생을 연구하기 위한 레이저 절제 시스템을 조립하고 정렬하는 방법을 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 레이저 글랜드, Thompson 편광자, 반파장판, Turning 미러, 페리스코프 레일 및 레일 미러를 브레드보드에 장착합니다. 다음 단계는 레이저 빔을 현미경 콘덴서 렌즈에서 나오는 출력 빔에 맞춰 정렬하는 것입니다.

그 다음, 레이저 빔 확장 렌즈를 장착하고 정렬 및 배치하여 레이저 빔을 중심에 맞추고 발산을 없게 합니다. 절차의 마지막 단계는 미세 조정을 통해 레이저 어블레이션 지점을 이미지 초점과 일치시키는 것입니다. 최종적으로, XY NC 정렬이 완벽하지 않더라도 회절 제한 레이저 빔을 사용하면 주변 조직 손상을 최소화하면서 0.5 µm 크기의 축삭을 정밀하게 절단할 수 있습니다.

펨토초 레이저와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 15,000달러라는 상대적으로 저렴한 비용입니다. 또한 유지보수가 거의 필요 없으며 매우 정밀한 축삭 절단이 가능합니다. 이 방법은 예쁜꼬마선충의 축삭 재생에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 초파리, 제브라피시, 생쥐, 말초 신경계 및 인비트로(in vitro) 세포와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

기본적으로 표면에서 30 to 50 µm 이내에 있는 모든 세포입니다. 브레드보드 위에 구성 요소들을 배치한 후, 레이저 페리스코프 포스트와 높이 조절 레일 지지대를 볼트로 고정하는 것으로 시작하십시오. 이 시스템은 눈에 쉽게 손상을 줄 수 있는 Class 3B 레이저를 사용하므로, 레이저 안전 수칙을 엄격히 준수하시기 바랍니다.

공간 빔 레이저를 안전하게 다루는 방법에 대해 소속 물리 학과의 담당자와 상의하십시오. 정렬 과정 중에는 항상 레이저 출력을 최저로 설정하십시오. 접안렌즈를 통해 관찰할 때는 레이저 셔터가 기계적으로 닫혀 있고 레이저 전원이 꺼져 있는지 반드시 확인하십시오.

이제 현미경의 위치를 잡습니다. 먼저, 현미경을 레일 축에 맞춥니다. 둘째, 현미경 콘덴서 렌즈에서 나오는 투과광 빔에 맞춥니다. 셋째, 레일에 부착된 조절 가능한 조리개나 렌즈를 사용하여 레일의 양 끝을 콘덴서 빔에 맞춥니다.

진행하기 전, 수평계와 실험실 잭을 사용하여 레일 높이를 조절하십시오. 레일의 양 끝이 정렬되었는지 확인하십시오. 이제 레이저 빔이 글랜드, Thompson 편광자와 반파장판을 통과하며 회전 시 가장자리에 닿지 않는지 확인하십시오.

하프 플레이트(halfway plate)를 사용하여 모든 구성 요소가 브레드보드에 고정된 상태에서 레이저 출력을 조정합니다. 레이저를 켜고 펄스 주파수를 100 연속 모드로 설정한 후, 하프 플레이트를 이용해 출력을 최소로 낮춥니다. 포스트잇이나 렌즈 페이퍼를 사용하여 레이저 빔을 시각화하십시오.

이제 브레드보드에서 레이저 빔을 위로 올립니다. 레이저부터 시작하여 키네마틱 마운트 거울들을 순차적으로 조정하고 고정하여, 빔이 상승 레일 끝에 장착된 거울까지 도달하게 합니다. 완료 후, 레이저 빔은 거울의 중심부에 대략적으로 정렬되어야 하며, 현미경의 투과 광빔과 레이저 빔을 정렬하기 전 거울들은 레이저 빔 축에 대해 대략 45도로 배치되어야 합니다.

중간 모듈의 ND 필터와 조리개를 모두 제거하거나 개방하십시오. 이제 부수적인 손상을 최소화하면서 축삭을 정밀하게 절단하기 위한 가장 중요한 단계를 시작하겠습니다. 가장 작은 어블레이션 스폿을 얻기 위해 최저 레이저 출력에서 x, y, z축의 레이저 정렬을 정밀하게 수행하겠습니다.

레이저와 투과광 빔을 종이 위에서 동시에 확인할 수 있습니다. 먼저 종이를 현미경 포트 근처에 배치하십시오. 이제 페리스코프 상단의 거울과 레일 끝의 거울에 있는 조동 나사를 사용하여 레이저 정렬을 시작하십시오.

정렬된 콘덴서 렌즈와 열려 있는 대물렌즈 터렛 사이에 종이를 놓습니다. 레일 거울의 미세 조정 다이얼을 계속 사용하여 레이저 빔을 더 큰 투과광 빔의 중심에 맞춥니다. 이제 클램프로 현미경을 고정합니다.

레이저 정렬을 평가하는 추가 단계는 서면 원고에서 확인할 수 있습니다. 300 µm 레이저 빔을 33배로 확장하여 10 mm 대물렌즈의 후방 개구부를 채우기 위해 듀얼 갈릴레이 빔 확장기를 설치해야 합니다. 먼저 4개의 렌즈를 캐리어에 장착하십시오.

그런 다음 모든 렌즈가 동일한 광축 상에 위치하고 레이저 빔에 정확히 수직이 되도록 레일에 부착합니다. 레이저를 켜고 출력을 최소로 조절한 뒤 연속 모드로 설정합니다. 각 렌즈를 통과하는 빔 정렬을 대략적으로 조정합니다.

종이를 사용하여 빔을 확인하십시오. 이제 레이저를 끕니다. 레이저에 안전 셔터를 장착하고 레이저 빔 경로에서 현미경을 제거하십시오.

레이저를 다시 켜고 근처 벽면에 투사하여 확인합니다. 렌즈의 미세 조정 다이얼을 사용하여 빔을 확장합니다. 그다음, 마지막 두 개의 키네마틱 마운트 거울을 조정하여 대물렌즈 후면 조리개의 예상 위치에 균일한 밝기의 원형 빔이 정렬되도록 합니다.

종이를 사용하여 빔의 크기와 균일도를 확인하십시오. 그런 다음, 종이를 렌즈에서 더 멀리 이동시킴에 따라 빔 크기가 어떻게 변하는지 관찰하여 빔을 제로 컨버전스(zero convergence) 상태로 조정하십시오. 레이저를 끄고 기계식 셔터를 닫으십시오.

고정 클램프를 사용하여 현미경을 레이저 빔 경로로 다시 밀어 넣어 정확한 정렬을 정의합니다. 현미경의 반대편에 클램프를 다시 장착하되, 꽉 조이지는 마십시오. 이제 레이저를 켭니다.

안전 셔터를 제거하고 대물렌즈 터렛을 개방 위치로 회전시킨 후, 스테이지 위에 종이를 놓아 콘덴서에서 나오는 투과광 빔 중앙에 확장되고 균일한 레이저 빔이 보이는지 확인합니다. 빔이 중앙에 위치하지 않은 경우, 현미경 고정 클램프를 풀고 현미경을 조심스럽게 밀어 빔의 중심을 맞춥니다. 이제 안전 셔터를 닫고 레이저를 트리거 모드로 설정합니다.

60배 대물렌즈를 제자리에서 회전시킵니다. 이제 타겟 슬라이드 상의 표면 스크래치 이미지를 촬영합니다. 안전 셔터를 제거하고, 어블레이션 레이저를 작동시킨 후, 최소 어블레이션 스팟이 생성되도록 레이저 출력을 조정합니다.

스팟은 원형이어야 하며 이미지 중심, 즉 어블레이션 스팟의 중심에서 5~10 µm 이내에 위치해야 합니다. 빔 프로파일을 균일하게 유지하고 스팟을 중심에 맞추기 위해, 키네마틱 마운트 레일 미러의 미세 조절 장치를 사용하여 레일 장착 미러와 상단 페리스코프 미러를 반복적으로 조정해야 합니다. 포커스를 1 µm 단계로 체계적으로 위아래로 이동시키며 각 단계에서 어블레이션 레이저를 트리거하여 레이저의 Z 초점을 평가하십시오.

빔이 올바르게 확장 및 정렬되고 수렴도가 정확하게 조정되었다면, 이미지 초점에서 최대 절제가 일어나야 하며, 초점 상단 또는 하단 1 µm 지점에서는 절제가 약하거나 전혀 일어나지 않아야 합니다. 최대 절제 지점이 이미지 초점보다 위에 있거나 아래에 있다면, 갈릴레이 망원경의 렌즈 L3를 이동시켜 레이저 절제가 이미지 초점과 일치할 때까지 확장 빔의 Z 초점을 최종 조정하십시오. 선충을 맞춤형 슬라이드에 고정하고 구축된 시스템을 사용하여 축삭을 절제하였으며, Laser exo somy 및 축삭 재생의 타임랩스 이미징 결과가 매우 견고하게 나타났습니다.

전동 스테이지를 사용하여 다섯 마리의 서로 다른 동물에서 유래한 다섯 개의 축삭을 하나의 슬라이드 상에서 일상적이고 정밀하게 절단하고 이미징할 수 있었습니다. 축삭의 이미징 시간이 제한 요인이었습니다.

약 10%의 실험에서 고품질의 타임랩스 영상을 얻었습니다. 나머지 실험들 또한 모두 양호한 데이터를 제공하였으나, 일반적으로 고정 후 5~8시간이 지난 시점부터 발생한 벌레의 미세한 떨림 현상으로 인해 시각적인 완성도는 다소 낮았습니다. 이 절차를 수행할 때는 x, y 및 z축의 레이저 정렬 상태를 정확하게 평가하는 것이 항상 중요합니다.

축삭을 절단하려 할 때 발생하는 가장 흔한 문제는 부수적인 손상이 생기거나 축삭을 전혀 절단하지 못하는 것이며, 이는 거의 항상 레이저 정렬이 잘못되었기 때문에 발생합니다. c Agains의 축삭 재생 시각화를 위한 이 레이저 절제 시스템과 기술을 통해 유전자 변이가 축삭 재생에 미치는 영향을 일상적으로 분석할 수 있습니다. NCL Agains.