줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

본 프로토콜은 키토산 마이크로스피어(chitosan microspheres)에서 콜라겐 겔 스캐폴드로 줄기세포를 전달하여 회수 및 배양하는 인비트로(in vitro) 전략을 제공합니다. 먼저, 일차 지방세포 줄기세포를 유화하여 키토산 마이크로스피어 제제를 회수합니다. 다음으로, 줄기세포를 키토산 마이크로스피어에 파종하고 8 $\mu\text{m}$ 공극 크기의 멤브레인 배양 플레이트 인서트에서 배양하여 CS가 로딩된 CSM을 생성한 후, 마지막으로 마이크로스피어 전달 시스템을 3차원 콜라겐 겔 스캐폴드와 혼합합니다.

궁극적으로, 이 CSM 시스템은 재생 의학과 약물 전달 분야에서 활용될 가능성이 있습니다. 세포 주입이나 미세 캡슐화와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 세포가 운반체 물질에 부착되어 초기 적용 후에도 지속될 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자의 경우, esan 미세구체가 고유의 정전기를 띠고 있어 수행에 어려움을 겪을 수 있습니다.

또한, 세포를 자극하지 않고 마이크로스피어 층 위에 로딩하는 것은 매우 까다로운 작업입니다. 회음부 및 표피 지방 조직을 절제하여 세척하고, 조직을 잘게 다진 후 1% FBS가 포함된 25 mL의 HBSS에 1~2 g을 옮깁니다. 원심분리 후, 부유하는 지방 조직층을 125 mL 삼각 플라스크에 수집합니다.

25 milliliters의 collagenase type two를 첨가하고 궤도형 진탕기(orbital shaker)에서 반응물을 배양합니다. 이제 오일 및 지방층 아래의 액체 분획을 조심스럽게 제거하고, 170 microns 크기의 나일론 메쉬 필터로 순차적으로 여과합니다. 25 milliliters로 두 번 세척한 후 원심분리를 통해 세포를 회수합니다.

HBSS 재현탁 후, 펠릿을 보충제가 첨가된 mesen pro 성장 배지 30 milliliters에 현탁합니다. 정제된 지방 유래 줄기세포를 두 개의 T 75 배양 플라스크에 나누어 담고, 37 degrees Celsius의 5% carbon dioxide 습윤 배양기에서 ASC 준비물을 증폭시킵니다. 이 CSM 프로토콜은 이온 코어 기술을 이용한 수중유(water in oil) 유화 공정입니다.

오버헤드 교반기와 마그네틱 교반기를 이용해 서로 반대 방향으로 1시간 동안 동시에 교반하여 100 mL의 오일 상 혼합물에 6 mL의 키토산 수용액을 유화시켜 안정적인 수-유 유화액을 만듭니다. 여기에 n-옥톨에 희석한 1% 수산화칼륨 1.5 mL를 4시간 동안 15분마다 첨가합니다. 이온 가교 반응이 완료되면 오일 상을 천천히 따라내고, 구체를 즉시 100 mL의 아세톤에 넣습니다. 오일 상이 완전히 제거될 때까지 아세톤으로 구체를 세척합니다.

그런 다음 회수된 구체들을 진공 상태에서 건조합니다. 입도 분석기를 사용하여 평균 CSM 입자 크기, 밀리그램당 표면적 및 단위 입방 부피를 결정하기 위해 건조 처리합니다. 잔류 염을 제거하기 위해 CSM을 멸균수로 3회 세척하십시오.

이제 세포 실험에 사용할 수 있도록 50 mL 유리 튜브에 담긴 CSM 준비물을 절대 알코올로 멸균하고, 5 mg의 미세구체(microspheres)를 1 mL의 0.5% TNBS 용액과 혼합하여 40 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 3 mL의 6 N 염산을 첨가하고 60 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 시료를 실온으로 냉각한 후, 5 mL의 탈이온수와 10 mL의 에틸 에테르(Ethel Ether)를 첨가합니다.

유리 TNBS를 추출하기 위해 수성층에서 5 mL의 분취액을 취하고, 상온으로 냉각한 후 잔류 에테르를 증발시키기 위해 항온수조에서 40 °C로 15분 동안 가열합니다. 분광광도계를 사용하여 15 mL의 물로 희석합니다. TNBS를 공시료(blank)로 사용하여 준비된 키토산 미세구의 흡광도를 345 nm에서 측정합니다.

CSM 제조에 사용된 키토산의 양도 측정하십시오. 이제 키토산의 총 아미노기 수 대비 CSM의 유리 아미노기 수를 계산하십시오. 멸균된 CSM 5mg을 멸균된 HBSS에 넣고 하룻밤 동안 평형화하십시오.

CSM을 24웰 배양 플레이트용 8µm 멤브레인 인서트로 옮깁니다. CSM이 가라앉은 후, HBSS를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이제 인서트 내부에 300µL의 성장 배지를 추가하고, 인서트 외부에 700µL의 성장 배지를 추가합니다.Resus.

지방 유래 줄기세포를 200 µL의 성장 배지에 부유시킨 후, 배양 플레이트 내부의 CSM 위에 파종합니다. 37 °C, 5% carbon dioxide 가습 배양기에서 24시간 동안 배양합니다. 인서트 막으로 이동한 세포가 흐트러지지 않도록 주의하며, ASC가 적재된 CSM을 멸균 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

이제 잔여 배지를 제거하고 각 튜브에 250 µL의 신선한 성장 배지를 추가합니다. 5 mg/mL MTT 용액 25 µL를 첨가하고 4시간 동안 배양합니다. 배지를 제거하고 250 µL의 dimethyl sulf oxide를 첨가한 후, 포르마잔 복합체를 용해시키기 위해 볼텍싱합니다. CSM을 2,700 G에서 5분 동안 원심 분리합니다.

630 nanometers를 참조 파장으로 하여 570 nanometers에서 상층액의 흡광도를 측정합니다. 알려진 수의 생존 가능한 A SC로부터 얻은 흡광도 값과 비교하여 CSM과 관련된 세포 수를 결정합니다. A SC가 적재된 CSM 5 milligrams를 7.5 milligrams per milliliter의 쥐 유래 제1형 콜라겐(Type one collagen extracted from rat's)과 혼합합니다.

꼬리 건(tail tendon)의 pH를 2N 수산화나트륨을 사용하여 6.8로 조정한 후 배양 플레이트에 붓습니다. 섬유화(fibrillation)를 위해 삽입한 다음 12웰 플레이트로 옮겨 30분 동안 배양합니다. 배양 기간 동안 이틀마다 collagen A-S-C-C-S-M 겔의 배지를 계속해서 교체해 줍니다.

또한 표준 현미경 기술을 사용하여 CSM에서 겔로 세포가 방출 및 이동하는 것을 모니터링하십시오. 다음 예시는 키토산 마이크로스피어에서 콜라겐 겔 스캐폴드로 지방 유래 줄기세포를 전달하는 인 비트로(in vitro) 전략을 설명합니다. SEM 및 TEM 이미지는 균일한 크기의 다공성 CSM이 제조되었음을 나타냅니다.

마이크로스피어를 일차 지방 유래 줄기세포와 함께 배양한 결과, CSM 칼슘 am 1mg당 4,000개의 세포가 확인되었습니다. 단일 세포(SC)의 염색 결과, 세포가 CSM 전체로 퍼지며 마이크로스피어의 다공성 틈새로 필로포디아(filopodia)를 뻗어내는 것이 관찰되었습니다. 세포가 로딩된 CSM을 콜라겐 겔과 혼합하자, 세포들이 겔 내부로 이동하였으며 시간에 따른 이동 경로를 추적할 수 있었습니다.

이 기술의 함의는 즉각적으로 광범위하고 만성적인 조직 손실 치료로 확장됩니다. 하지만, 이 치료법은 다양한 세포 및 다양한 수준의 연조직 및 심장 조직 손실 치료에 사용되는 바이오 소재와 결합할 수 있는 다재다능함 덕분에 훨씬 더 많은 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법이 숙주 세포 전달에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 것으로 기대됩니다.

또한 이는 주사제와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있으며, 치료제를 전달하거나 세포와 치료제를 함께 전달하는 하이브리드 시스템을 개발하는 데 활용될 수 있습니다.