층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

본 비디오 논문의 전반적인 목적은 부착 세포를 층류 조건에 노출시키고, 정량화가 가능한 유체 전단 응력에 대한 반응을 평가하는 기술을 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유동 챔버 없이 유동 회로를 구성합니다. 회로는 저장조, 펄스 댐퍼, 하드 튜브, 소프트 튜브, 4방향 스톱콕 및 연결용 루어 어댑터, 그리고 공기 필터로 구성됩니다.

다음 단계는 멸균 조건 하에서 세포 배지와 같이 원하는 풍부한 완충액으로 회로를 채운 후, 펌프를 가동하여 펄스 댐퍼를 채우고 튜브 내의 공기를 제거하는 것입니다. 이어서 세포가 안착된 슬라이드를 유동 챔버의 하단 플레이트에 삽입합니다. 절차의 마지막 단계는 유동 챔버를 연결하여 유동 회로의 조립을 완료하는 것입니다.

최종적으로, 형광 현미경을 통해 투명 챔버 내에서 유체 전단 응력 노출 하에 정렬된 형광 표지 혈관 내피 전구 세포의 결과를 얻어 세포의 기능적 거동을 연구할 수 있습니다. 세포의 생체 내 생리를 모사하기 위해서는 세포에 유체 전단 응력을 가하는 것이 필요합니다. 본 연구에서는 유동 조건 하에서 세포를 연구하고 투명 챔버를 통해 관찰할 수 있도록 평행판 유동 챔버와 연속 유동 회로를 설계하였습니다.

이 기술은 의학과 공학 분야에서 가치 있는 연구 도구로 활용될 수 있습니다. 당사의 유동 챔버(flow chamber)를 사용하면 정립 현미경 또는 도립 현미경을 통해 흐름 하에 있는 세포를 간헐적으로 또는 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 또한, Dr.Ach Nick의 설계 덕분에 연구자들은 표준 현미경 렌즈를 사용하여 투명하거나 방사선 불투과성인 표면 위에서 세포를 이미징할 수 있습니다.

또한, 이는 유동 조건 하의 세포에 약물이 미치는 영향을 연구함으로써 약리학 연구의 중요한 도구로 활용될 수 있습니다. 여러 단계가 프로토콜을 읽는 것만으로는 숙달하기 어렵기 때문에, 장치 구성의 시각화가 매우 중요합니다. Dr.Ock Next 연구실에서 일반적으로 사용되는 플로우 챔버와 유동 회로의 설정 방법에 대해 단계별 지침을 제공하겠습니다. 유동 회로를 조립하는 방법은 다음과 같습니다.

먼저 36인치 길이의 하드 튜브 세그먼트를 펄스 댐퍼의 한쪽 끝에 연결하고, 반대쪽 끝에 18인치 길이의 소프트 튜브 세그먼트를 연결합니다. 18인치 소프트 튜브 섹션의 끝에 1/8인치 수형 루어 어댑터를 장착합니다.

수컷 루어(male lure)를 1/8인치 암컷 루어 어댑터에 연결합니다. 암컷 루어를 새로운 18인치 길이의 소프트 튜빙 세그먼트에 부착합니다. 250밀리리터 유리 비커 캡에 구멍 세 개를 뚫습니다.

튜빙을 맞추기 위해, 1.5 inch 길이의 소프트 튜빙 세그먼트를 한쪽 구멍에 삽입하여 공기 배출구로 사용합니다. 하드 튜빙과 소프트 튜빙의 자유단을 캡의 나머지 두 구멍을 통해 저장소 역할을 할 250 milliliter 유리 병 내부로 삽입합니다.

딱딱한 튜브가 저장조 바닥까지 닿도록 하십시오. 회로 설정 전반에 걸쳐 무균 상태를 유지하는 것이 이 절차의 성공에 매우 중요합니다. 따라서 모든 부품은 멸균되어야 하며, 작업 전 과정에서 멸균 장갑을 착용해야 합니다.

조립된 부품 외에 다음 부품들을 반드시 멸균해야 합니다. 완전한 플로우 챔버 1개, 3x2인치 크기의 소프트 튜빙 세그먼트(수컷 1개, 암컷 1개), 1/8인치 루어 어댑터, 1/2인치 평두 나사 4개, 6 5/16인치(인치당 나사산 30개) 평두 나사 8개, 핀셋 1쌍, 유리 슬라이드 1개, 그리고 수건 2개를 증기로 멸균합니다.

121°C에서 60분 동안 오토클레이브 멸균을 수행합니다. 유로 회로 유량 챔버, 4방향 콕 2개, 1방향 콕 1개 및 모든 멸균된 부품들을 멸균 구역 위에 배치합니다. 멸균 장갑을 착용한 상태에서 두 개의 4방향 콕을 연결합니다.

열려 있는 샘플 포트에 캡을 씌웁니다. 유로 회로의 두 소프트 튜빙 세그먼트를 연결하는 수컷 및 암컷 루어 어댑터를 분리하고 연결된 스톱콕을 삽입합니다. 리저버에 삽입된 소프트 튜빙을 30 milliliter 시린지에 연결하고 시린지 피스톤을 제거합니다.

병에 EPC 배지 125 milliliters를 채웁니다. 소프트 튜빙을 스톱콕에 다시 연결합니다. 공기 배출구에 멸균 시린지 필터를 장착합니다.

이제 유동 회로를 37 °C, 5% 이산화탄소가 공급되는 가습 배양기로 옮깁니다. 이 유형의 coal Palmer 튜빙에 사용하도록 지정된 master flex 롤러 펌프 헤드에 하드 튜빙을 고정하십시오. 튜빙이 롤러 펌프 장착 트랙과 겹치지 않도록 확인하십시오.

마킹 펜을 사용하여 펌프 헤드의 양쪽에서 나오는 튜빙 지점을 표시하십시오. 모든 스톱콕이 샘플 포트 쪽으로는 닫혀 있고 유로를 따라 열려 있는지 확인한 후, 펌프를 가동하십시오. 흐름 방향을 확인하십시오.

PERFUSE 8은 유리 저장조에서 하드 튜빙을 통해 펄스 댐퍼로 이동해야 합니다. 유동 챔버 조립을 위해, 멸균 장갑을 착용한 상태에서 2인치 소프트 튜빙 세그먼트 하나를 1/8인치 암형 루어 어댑터에 연결하십시오. 또 다른 2인치 소프트 튜빙 세그먼트를 1/8인치 수형 루어 어댑터에 연결하십시오.

암형 루어 어댑터가 달린 2인치 소프트 튜빙을 유입구 포트에 연결하고, 수형 루어 어댑터가 달린 2인치 소프트 튜빙을 유출구 포트에 연결하십시오. 이 두 루어 어댑터에 4방향 스톱콕을 부착하십시오. 남은 2인치 소프트 튜빙 조각을 버블 트랩에서 나오는 측면 포트 커넥터에 연결하고, 멸균 핀셋을 사용하여 일방향 스톱콕을 부착하십시오.

세포가 배양된 슬라이드를 세포 배양 용기에서 꺼내 유동 챔버 바닥 플레이트의 홈에 배치합니다. 슬라이드의 세포 배양면이 위를 향하도록 배치되었는지 확인하십시오. 주사기나 피펫을 사용하여 10 milliliters의 가온된 EPC 배지를 세포 배양 슬라이드 위에 넣습니다. 배지가 유동 챔버 내의 슬라이드를 덮도록 하되, 바닥 플레이트의 O-링 위로 배지가 넘치지 않게 주의하십시오.

유동 챔버의 상단 플레이트를 하단 플레이트 위에 놓고 나사 구멍을 맞춥니다. 챔버 나사 플레이트 내부에 기포가 유입되지 않도록 두 플레이트를 평행하게 유지하며 결합합니다. 자동 배터리 구동 드라이버를 사용하여 유입측 기포 트랩 포트에 연결된 일방향 스톱콕을 열어 유입 기포 트랩의 공기를 제거합니다.

10 milliliter 주사기를 사용하여 유입 튜브를 EPC 배지로 부드럽게 세척한 다음, 해당 스톱콕을 잠그고 캡으로 닫습니다. 이제 유출 포트의 4방향 스톱콕을 열고 흐름 챔버를 통해 EPC 배지를 부드럽게 흘려보내 챔버 채널 내의 공기를 제거합니다. 다시 10 milliliter 주사기를 사용하여 모든 4방향 스톱콕 연결부를 캡으로 닫고 잠급니다.

조립된 유로 회로와 함께 유동 챔버를 가습 인큐베이터로 옮깁니다. 유로 회로 펌프를 일시 정지하고, 누출을 방지하기 위해 흐름 방향에 있는 스톱콕을 잠가 유로 회로를 차단합니다.

유동 챔버를 유동 회로에 연결합니다. 유동 챔버가 유동 회로에 연결되면, 흐름 방향으로 스톱콕을 엽니다. 유동 펌프를 다시 작동시키고 PERFUSE eight가 올바른 방향으로 흐르는지 확인합니다. 원하는 전단 응력에 맞게 유속을 조절합니다.

유동 실험 중에 광학 또는 형광 현미경을 통해 세포를 이미지화하기 위해 유동 챔버를 회로에서 분리할 수 있습니다. 이를 위해 스톱콕-스톱콕 연결 부위에서 유동 챔버를 유동 회로로부터 분리하십시오. 분석을 위해 관류액 샘플을 수집하십시오.

먼저, 펌프를 일시 정지하고 펄스 댐퍼(pulse dampener)와 가장 가까운 스톱 콕(stop cock)을 잠급니다. 보호 캡을 제거한 뒤, 오염되지 않도록 캡을 뒤집어 놓습니다. 샘플 포트에 소형 시린지를 삽입합니다.

샘플 포트와 펄스 댐퍼 방향의 회로는 열어둔 채, 유동 챔버 방향의 스톱콕을 잠급니다. 회로에서 원하는 양의 샘플을 취한 후, 시린지를 제거하기 전에 샘플 포트 방향의 스톱콕을 잠급니다. 채취한 샘플을 라벨이 부착된 바이알에 보관하고 -80 °C에서 냉동합니다.

샘플 포트를 다시 막고, 흐름을 시작하기 전에 모든 스톱콕이 열려 있는지 확인하십시오. 이 방법을 사용하면 인간 혈액 유래 혈관내피 전구세포를 15분 이내에 티타늄 슬라이드에 파종할 수 있으며, 생리적 전단 응력 하에서 부착시킬 수 있습니다. 이 그림에서 보듯, EPC는 15 dynes/cm²의 유체 전단 응력 하에서 파종 직후 약 210 µm²에서 3시간 후 약 657 µm², 48시간 후에는 약 1,152 µm²까지 흐름의 영향으로 확장됩니다.

이 광학 현미경 이미지는 인간 EPC의 무작위한 방향성을 보여줍니다. 100 dynes/cm²의 유속으로 3시간 동안 흐름을 가한 후 6시간 동안 정적인 상태로 유지했을 때, 세포들은 퍼져나갔으나 여전히 무작위한 방향으로 배열되어 있습니다. 100 dynes/cm²의 유체 전단 응력을 48시간 동안 가한 후, EPC들은 흐름 방향에 따라 정렬 및 배향되었습니다.

여기에서 EPCs는 CTO로 라벨링되었으며, 유동 후 사멸을 확인하기 위해 세포핵을 herx로 염색하였습니다. 비교를 위해, 이 이미지는 유동 방향으로 정렬된 티타늄 슬라이드 상의 돼지 EPCs를 보여줍니다. 48시간의 유동과 제곱센티미터당 15 dines의 전단 응력 노출 후, 세포 경계는 anti pcam 염색으로, 핵은 cytoxin 핵산 염색으로 염색하였습니다.

본 방법을 통해 분비된 세포 대사산물을 분석하거나 정량화하기 위해 미리 정해진 시점에 PERFUSE eight의 샘플을 얻을 수 있습니다. 여기 porcine EPC를 이용한 48시간 유동 실험 중 아질산염 생성의 예시가 제시되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 전 과정에서 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다.

또한, 지속적인 흐름을 시작하기 전에 유동 챔버 내의 기포 수를 줄이기 위한 필요한 조치를 취하는 것이 중요한데, 이는 기포가 세포를 떼어낼 수 있기 때문입니다. 또한, 실험 중 PERFUSE eight의 누출을 방지하기 위해 관류 전 유동 챔버와 회로의 모든 연결 부위를 확인할 것을 권장합니다. 이 챔버는 상단 및 하단 플레이트의 완전한 밀착을 가능하게 하고 진공 펌프 없이도 누출 없는 밀봉을 제공하는 O-링이 내장된 구조로 설계되었습니다.

이 기능은 실험 간 챔버 높이를 일정하게 유지하며, 고무 가스켓이나 별도의 조정 필요성을 없애줍니다. 당사의 유동 챔버는 표준 현미경 슬라이드를 사용합니다. 따라서 향후 추가 실험에 사용할 수 있는 다량의 세포를 확보할 수 있습니다.

예를 들어, 유동 처리 후 세포에서 추출한 RNA와 DNA를 통해 단백질 합성 또는 유전자 발현을 평가할 수 있습니다. 본 회로 설계에서는 분석을 위해 8개의 관류 샘플을 수집할 수 있으며, 유체 전단 응력 하의 세포에서 분비되는 산화질소의 주요 산화 대사물인 nitrite와 같은 세포 대사물을 정량화할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 부착 세포에 유체 전단 응력을 가하기 위해 유동 챔버와 멸균 유동 회로를 조립하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.