의 시각화 Caenorhabditis Elegans 표피 구조

이 절차의 전반적인 목표는 적색 형광 친지성 염료인 dye eye를 사용하여 투명한 살아있는 C. elegans의 큐티클을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 우선 염색을 위한 네마토드 개체군을 준비합니다. 그다음, 희석된 dye eye를 개체군에 첨가하고 배양합니다.

그런 다음 염색액에서 동물을 회수합니다. Dai로 염색된 큐티클의 형광 이미징을 통해 Ailey 및 Ann eye 생식 구조와 기타 외부 형태적 특징을 포함한 표면의 세부 사항을 확인할 수 있습니다. 직접 이미징, 형광, 형질전환 유전자 발현, 항체 염색, 전자 현미경 및 표지된 밀배아 응집소와 같이 이 투명한 유기체의 큐티클을 시각화하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수행하기 쉽고 상대적으로 빠르며 비용이 저렴하며, 살아있는 동물의 큐티클 구조에 대해 뛰어난 해상도를 제공한다는 점입니다.

이 방법은 세포 분비 및 큐티클 구성, 표피 세포 발달, 이성숙 유전자 경로, 선천성 면역, 형태적 특성의 발달 및 선충 진화와 같이 sea elegance 모델 시스템과 그 큐티클을 이용하는 많은 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차 시연은 제 연구실의 대학원생인 Robbie Schultz가 진행하겠습니다. D Eye를 다룰 때는 빛에 민감하다는 점에 유의하십시오.

D eye는 항상 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하십시오. 또한 DMF는 독성이 있고 DAI는 발암물질이므로 장갑과 실험복을 착용하십시오. Cyanide Dai는 매우 강력합니다.

표준 농도의 작업 희석액은 M9 배지 내 30 µg/mL의 DII이며, 단일 개체군당 400 µL의 작업 희석액만 필요합니다. 오염되지 않은 선충이 배양된 60 mm 플레이트로 시작하십시오. 0.5% Triton X 100 1.5 mL를 사용하여 플레이트에서 동물들을 세척하십시오.

M nine 완충액에서 액체를 원형으로 부드럽게 흔들어 모든 유충과 성체 동물을 분리시킨 후, 세척액을 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 즉시 2000 RRP M에서 30초 동안 원심분리하여 튜브 바닥에 동물을 모읍니다. 동물이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 최대한 제거합니다.

탐욕스럽지 않게 주의하여 처리하십시오. 1 mL의 M nine으로 동물을 세척합니다. 원심 분리하여 상층액을 제거하십시오.

세척 과정을 반복합니다. 다시 원심 분리하여 상층액을 제거합니다. 다음으로 30 µg/mL의 DAI가 포함된 M9 배지 400 µL를 튜브에 넣습니다.

튜브를 짧게 볼텍싱하여 동물을 재부유시킵니다. 그런 다음, 빛이 차단된 환경에서 튜브를 수평으로 눕힌 상태로 20 °C에서 350 RPM으로 3시간에서 16시간 동안 흔들어 줍니다. 앞서 설명한 몇 단계의 시간 준수가 중요합니다.

첫째, Triton X가 dai가 결합하는 지질을 제거하기 전에 먼저 씻어내야 합니다. 둘째, 큐티클이 균일하게 염색될 수 있도록 동물 표본을 dye eye 용액에 충분한 시간 동안 염색해야 합니다. 잠시 후, 결합되지 않은 eye를 제거할 수 있을 만큼 충분한 시간 동안 동물 표본을 먹이 위에서 회복시켜야 합니다.

염색이 끝나면 동물을 원심 분리하여 가라앉히고 염색액을 제거합니다. M9 배지 1 mL로 동물을 세척합니다. 결합되지 않은 염료를 제거하기 위해 동물을 원심 분리하여 가라앉힌 후 상층액을 제거합니다.

동물을 400 µL의 M9 버퍼에 다시 현탁하고, OP50 E. coli가 도말된 NGM 마이크로플레이트의 박테리아가 없는 부분에 붓습니다. 동물이 어둠 속에서 최소 30분 동안 회복하도록 두되, 회복 시간 동안 염료 형광이 사라지므로 하루를 넘기지 않도록 합니다. 동물은 염료 염색액에서 벗어나 먹이 쪽으로 이동해야 합니다.

이 동물들은 유리 염료로 인한 배경 형광이 적어 이미징하기가 더 쉽습니다. 먼저 슬라이드 위에 아가 패드(agar pad)를 준비하십시오. 사용되는 아가 패드의 두께를 일정하게 유지하기 위해 두 개의 스페이서를 사용합니다.

두 조각의 실험용 테이프를 유리 슬라이드 위에 층으로 붙여 스페이서를 제작합니다. 스페이서는 반복해서 사용할 수 있습니다. 다음으로, 깨끗한 유리 슬라이드를 두 개의 스페이서 슬라이드 사이에 길게 배치하고, 약 150 µL의 용융된 4-agar를 피펫으로 넣습니다.

깨끗한 유리 슬라이드 중앙에 올립니다. 녹은 AER 위에 추가 슬라이드를 AER과 두 개의 스페이서에 수직으로 배치하여 빠르게 덮어 한천 패드를 형성합니다. 커버 슬라이드를 조심스럽게 밀어 제거하며, 패드가 마운팅 슬라이드 상단 중앙에 위치하도록 유지합니다.

이제 선충 마취제 5 µL를 패드 위에 피펫으로 분주하고, 8~12마리의 개체를 마취제 안에 올려놓은 후 현미경 커버 글라스로 조심스럽게 덮습니다. 최소 40배 대물렌즈와 TRITC 필터 또는 기타 호환 필터가 장착된 복합 현미경이나 공초점 현미경을 사용하여 개체를 관찰합니다. Dye I의 형광 여기 최대 파장은 549 nm이며, 방출 최대 파장은 565 nm입니다.

결합된 다이(die)의 경우, 이미징이 이 프로토콜에서 가장 까다로운 부분입니다. 동물을 이미징하기 위해 장착하는 방법을 설명하지만, 사용할 화합물 또는 공초점 현미경에 대해 적절한 교육을 받아야 합니다. 염색 방법에 의해 조명된 세부 사항을 분해하기 위해서는 최소 60x 배율의 대물렌즈를 사용하는 것이 가장 좋다는 것을 확인했습니다.

이 섹션의 모든 이미지는 포스트 배아 단계의 C. elegans에서 63 x 대물렌즈를 사용하여 촬영되었습니다. 큐티클 표면은 원주 방향의 고랑에 의해 연간으로 분리되어 있으며, 일부 단계에서는 ailey라고 불리는 세로 능선이 나타납니다. 이 섹션의 모든 이미지는 포스트 배아 C. elegans에서 63 x 대물렌즈로 촬영되었습니다.

큐티클 표면은 원주 방향의 홈으로 분리된 환형 구조를 포함하며, 일부 단계에서는 aley라고 불리는 세로 능선이 나타납니다. 각 발달 단계의 큐티클 구조는 뚜렷한 구성과 패턴을 가지며, aley와 Aly의 능선 또는 홈은 표면 구성에 따라 형광 염색됩니다.

이 염색 고정법을 사용하면 모든 유충 및 성충 단계에서 회복 후 최대 하루 동안 가시성이 유지됩니다. 배경에 형광 반점이 간혹 관찰되기도 하지만 일반적이지는 않습니다. 이는 중간 정도의 큐티클 조직 결함을 보이는 성충 돌연변이 동물의 큐티클입니다.

Ailey ridge(날개 능선)는 불연속적이며 과잉 형성되어 있습니다. Ailey ridge는 융합되거나 분지 또는 이분되어 있으며, 이는 일반적인 형질전환 마커입니다. 우성 roll six 대립유전자는 큐티클의 뒤틀림을 유발하며, 이는 ailey에서 관찰될 수 있고 환상선(annuli)의 패턴을 불규칙하게 만들 수 있습니다.

Dai는 성체 자웅동체, 음문 및 성체 수컷의 꼬리 돌기와 부채를 포함한 다른 외부 큐티클 구조도 염색합니다. 또한 dai는 이와 같은 갈라진 꼬리와 같이 외부 형태의 미세한 결함을 강조할 수 있습니다. 예를 들어, 2시간 동안 염색하면 큐티클 염색이 얼룩덜룩하게 나타나지만, 환경적으로 노출된 뉴런은 염색될 수 있습니다. 적절하게 수행한다면, 이 기술은 숙달된 후 이미지 촬영 시간을 제외하고 4시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 큐티클 및 기타 외부 형태 구조 관찰을 위해 sea elegance를 die eye로 염색하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.