분리 LacZ를 표현 유동세포계측법를 사용하여 마우스 내이 (内耳) 조직의 세포를

다음 실험의 전반적인 목표는 유세포 분석법을 사용하여 신생 마우스 와우에서 lax Z 양성 세포를 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포의 생존력을 유지하고 충분한 시작 조직을 확보할 수 있도록 비교적 짧은 시간 내에 다수의 마우스 와우를 분리합니다. 두 번째 단계로, LAX Z 양성 세포를 해리한 후 표지하여 분리(sorting)를 위한 조직 준비를 마칩니다.

그 다음 유세포 분석기를 통해 세포를 분리합니다. 이렇게 얻어진 LAX Z high 및 lax low 집단은 후속 실험에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 내이 내의 유전자 프로필이나 특정 세포 집단이 무엇인지와 같이 귀 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

본 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 의대생인 Taha Gen A가 진행하겠습니다. 먼저 35 millimeter 페트리 접시에 HBSS를 채우고 이를 아이스 블록 위에 놓습니다. 그다음 아이리스 가위를 사용하여 안락사시킨 생후 0-3일 된 axon, two laxy 리포터 및 야생형 생쥐 12-15마리의 머리를 절단합니다.

머리를 얼음 위에 놓인 60 millimeter 페트리 접시에 배치합니다. 다음으로, 5번 Dumont 포셉과 아이리스 가위를 사용하여 머리에서 하악골과 혀를 절제한 후, 구개 수준에서 두개저를 절단합니다. 이제 칼바니아(calvaria) 상부의 피부를 제거하고, 가위를 대후두공(foramen magnum) 하단부에서 구개 중앙까지 삽입하여 두개저를 횡단 절단합니다.

가위로 구개부의 절단면부터 양측 calver의 상단까지 다시 절개합니다. 이때 이낭(otic capsule)이 손상되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 프레임과 magnum의 상단에서 시작하여 경구개(hard palate)의 관상 절단면까지 45도 각도로 2번 절개하여 측두골 분리를 완료합니다.

그 다음, 분리된 측두골을 HBSS가 담긴 35 millimeter 페트리 접시에 넣어 아이스 블록 위에 놓고, 아이스 블록을 멸균 해부 후드로 옮깁니다. 이어서, 또 다른 35 millimeter 페트리 접시에 PBS를 채워 아이스 블록 위에 놓습니다. 55번 핀셋 두 개를 사용하여

이경낭(otic capsule)을 덮고 있는 측두골에서 피질, 뇌줄기와 소뇌를 조심스럽게 제거하여 미세해부를 시작합니다. 그런 다음 이경낭을 제거하지 않은 상태에서, 전정와우신경 입구부터 시작하여 이경낭 내부로 이어지는 와우낭(cochlear capsule)의 일부를 깎아냅니다. 와우 기저부가 노출되면, 코르티기관(organ of corti)과 주변 조직을 조심스럽게 끌어냅니다.

그런 다음 기저부부터 시작하여 남아 있는 나선신경절과 혈관조를 제거하고, 달팽이관을 PBS가 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. 코팅되지 않은 6-well 배양 접시의 1~2개 well 중앙에 멸균 PBS 50 µL를 피펫으로 분주합니다. 그런 다음 각 PBS 방울에 최대 20개의 달팽이관을 옮깁니다.

다음으로 0.125% trypsin 50 µL 분주액을 37 °C 항온수조에서 약 2분 동안 예열합니다. 그 후 dish를 흔들지 않도록 주의하며 trypsin을 와우(cochlea)에 첨가합니다.

와우를 37 °C에서 8분 동안 배양합니다. 각 방울에 50 µL의 대두 트립신 억제제를 첨가하여 트립신화를 중단시킨 후, P 200 피펫맨을 125 µL로 설정하여 완전 배지 50 µL를 추가로 첨가합니다. 300 µL 뭉툭한 피펫 팁을 사용하여 기포가 생기지 않도록 주의하며 세포를 80회 부드럽게 파이펫팅합니다.

그 다음 각 방울을 파이펫팅하여 잘 섞어준 후, 각각에 완전 배지 200 µL를 추가로 넣습니다. 이제 세포를 40 µm 세포 스트레이너를 통해 동일한 6-웰 플레이트 내의 새로운 웰로 통과시킵니다. 그런 다음 각 웰의 세포를 개별 표준 FACS 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 세 개의 튜브 각각에 100 µL의 야생형 세포를 넣은 후, CUG 전용 튜브에만 300 µL의 완전 배지를 가해 희석합니다. 대조군으로 axon, 두 개의 LAX Z 세포 10 µL를 390 µL의 완전 배지로 희석합니다. 나머지 axon 두 lax Z 세포는 400 µL OT가 들어있는 fax 튜브로 옮깁니다.

그 후 튜브를 37 °C 습윤 배양기에서 10분 동안 배양한 다음, 각 해당 fax 튜브에 희석된 CUG 200 µL를 첨가합니다. 이어서 모든 튜브를 빛으로부터 차단한 상태로 37 °C 습윤 배양기에서 세포를 25분 동안 배양합니다. 세포 배양 중에 염색을 위해, 갓 조제한 heaps plus FBS 10 mL를 15 mL 튜브에 넣고 해당 튜브를 얼음에 둡니다.

그 다음, 빛 노출을 최소화하기 위해 조명을 끈 상태에서 멸균 후드 내의 각 튜브에 얼음처럼 차가운 heap 솔루션 1.8 milliliters를 첨가합니다. 이어서 실온에서 1200 RPM으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 후 상층액을 제거하고 펠렛을 300 microliters의 완전 배지에 재현탁합니다.

분류용 샘플의 모든 분주액을 하나로 모은 다음, 각 해당 튜브에 propidium iodide를 최종 농도가 1 µg/mL가 되도록 첨가하십시오. 마지막으로, 세포를 덮은 후 다시 한번 얼음에 놓으십시오. 우선 염색되지 않은 야생형 세포의 이벤트 1000개를 수집하여 forward scatter 대 side scatter 도표에서의 세포 분포를 결정함으로써 분류 게이트를 설정하십시오.

필요에 따라 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터를 조정하십시오. 그런 다음 염색되지 않은 야생형, PI 염색 야생형 및 CUG 염색 축삭으로 보정하십시오. 두 개의 LAX Z 세포를 사용합니다.

두 개의 FACS 튜브에 500 µL의 완전 배지를 채웁니다. 그런 다음 wild type PI 염색 및 axon two Lae CUG 염색 세포 게이트를 사용하여 분석을 시작하고, 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter) 플롯을 기반으로 데브리스(debris)를 제외합니다. 전방 산란광 높이(forward scatter height) 대 전방 산란광 면적(forward scatter area) 플롯을 사용하여 더블렛(doublets)과 응집물을 제외합니다.

그 다음, 전방 산란 영역 대 PE sci five 영역 플롯을 기반으로 PI 양성 사멸 세포를 제외합니다. 각 게이트 배치에 대해 전방 산란 영역 대 cascade 또는 Pacific blue 영역의 플롯을 설정합니다. 야생형 세포로 설정한 모든 게이트와 야생형 세포의 플롯을 사용하여, axon two laxy PI 및 CUG 염색 세포가 포함된 정렬 샘플 튜브로부터 10,000개의 이벤트를 분석합니다.

전체 이벤트 수의 1% 미만인 cascade blue high 세포에 대한 게이트를 생성합니다. cascade Blue High 게이트에는 이제 Axon two laxy 샘플 세포의 약 15~20%가 포함되어야 합니다. Axon two laxy 세포 분석 플롯을 사용하여 이러한 axon two high 세포를 설정한 후, 앞서 언급한 게이트 설정 전략을 사용하여 형광이 가장 낮은 세포 15~20%에 대한 게이트를 생성합니다.

분리된 세포들을 완전 배지가 들어 있는 fax 튜브에 분해하여 담으며, 분리 과정 동안 수집 튜브는 4 °C로 냉각된 챔버에 보관하십시오. 유세포 분석기에서 측정된 각 세포군(population)의 세포 수를 기록하십시오. 왼쪽은 분리된 wild type, 오른쪽은 axon two LA Z의 전방 산란 영역(forward scatter areas) 대비 측방 산란 영역(side scatter areas)을 나타낸 두 그림입니다.

달팽이관 세포들이 나타나 있습니다. Y축에 더 가깝게 위치하며 debris negative population으로 지정된 이벤트들보다 훨씬 크기가 큰 뚜렷한 이벤트 그룹들의 게이팅을 확인하십시오. 일반적으로 이 두 패널의 야생형 및 axin two LAX Z 달팽이관 모두에서 40~45%의 debris free 세포가 회수됩니다.

이전 단계에서 게이팅된 데브리스(debris)에서 더블렛(doublets)을 제외하기 위해 전방 산란광 높이(forward scatter height) 대 전방 산란광 면적(forward scatter area)을 사용합니다. 플롯의 예상 선형 특성에서 벗어나는 음성 군집 이벤트들은 제외됩니다. 이러한 준비 과정을 통해 일반적으로 지정된 게이트 내에 71.1%의 이벤트가 확보됩니다.

이 산점도에서 관찰되는 바와 같이, PE SCI 5채널로 검출된 Propidium iodide는 사멸 세포를 배제하는 데 사용됩니다. 분류된 세포의 약 95%는 생존 상태였으며, 이 패널들에서 PI를 흡수하지 않았습니다. Cascade blue 채널은 오른쪽 그림에 나타난 것과 같이 형광 기질 CUG를 검출하는 데 사용되었습니다.

평균적으로, CUG 양성 세포의 상위 약 20%가 lae high 세포이며, 이는 동물 10~12마리당 약 15,000개의 axon, 두 high 세포에 해당합니다. 이 영상을 시청한 후에는 세포 분화 실험과 유전자 프로파일링과 같은 실험 모두를 위해, 유세포 분석법을 이용하여 내이 조직에서 laxy high 세포를 준비하고 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.